卡铂诱导视网膜母细胞瘤SO-Rb50细胞系耐药的研究

摘要

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)是儿童最常见的眼内恶性肿瘤，也是仅次于白血病的儿童第二常见的恶性肿瘤。近年来发病率有上升趋势[1]，多见于婴幼儿，既可致盲也可致命。尽管目前治疗手段很多，包括光凝、冷凝、放疗、光动力学、化疗等治疗方法，但这些治疗仅对早期的RB有效，而临床上RB被发现时往往已经到了中晚期，对于中晚期的RB眼球摘除仍然是当前主要治疗手段。 眼球摘除使患儿致残并造成患儿心理障碍影响生存质量，外放射治疗可造成眼部并发症及眼眶发育畸形，而有效的化疗不仅可以提高肿瘤治愈率，挽救患儿生命，而且可以减少眼球摘除率，保存部分视力，提高患儿生活质量，减轻社会负担。 但是早在上世纪80年代在对RB化疗效果的研究中就发现，尽管单独使用化疗早期就能使肿瘤体积缩小，显示出化疗效果，可是在化疗过程中多数患者会出现耐药。st Jude儿童研究医院的Wilson[1]对20例视网膜母细胞瘤患者(36只眼)单纯化疗8个疗程，结果在仅仅约1年半的随访中，83％的Ⅰ～Ⅲ期病人及100％的Ⅳ～Ⅴ期病人出现疾病进展，且50％出现在化疗后4周内。Gunduz等对1998年12月至2003年1月期间71例RB患者(105)眼接受化疗6个周期后的结果进行分析后认为，化疗的失败是RB对化疗药物耐药所致[2]。 目前国内外对肺癌、乳腺癌、白血病、卵巢癌、胃癌、肝癌等肿瘤的多药耐药及其耐药逆转研究较多[3-10]，而对视网膜母细胞瘤的多药耐药机制及其逆转研究则较少见。最先提出在RB中存在多药耐药导致化疗不敏感的是Chan HS，他发现在11例RB细胞株中，有5例存在多药耐药现象，它们对植物生物碱类、蒽环类抗生素、烷化剂、抗代谢药物存在交叉耐药，但其中只有两例曾接受过化疗治疗[11]，这说明RB存在着原发和继发多药耐药现象。后来他用免疫组化方法从5例多药耐药和2例耐植物碱的RB病理组织中发现P170过度表达，而在4例化疗敏感的病理组织中，未发现有P170的高表达[12]。他随后发现部分病例在化疗过程中即使使用了P170抑制剂(环孢霉素A)，也还是对化疗药物不敏感，在这些化疗失败病例的病理组织切片中发现有MRP的表达，说明除了P170高表达可引起RB耐药，MRP的高表达也可引起[13]。本研究利用我科室建立的国内第一个RB细胞株SO-RB50，模拟临床化疗周期，采用临床化疗中常用的一种抗癌药物卡铂(carboplatin，CBP)诱导SO-Rb50细胞成为耐药细胞So-Rb50／CBP。 随后我们对SO-RB50和So-Rb50／CBP的生长情况和它们对几种临床常用化疗药的IC50值，以及LRP、GST-π、P170和MRP耐药蛋白的表达及其mRNA的含量做了相关研究。所有试验均使用对数生长期细胞。 1.研究目的： 1.1采用临床常用化疗药物卡铂对SO-Rb50的大剂量冲击诱导方法，诱导SO-Rb50成为耐药细胞SO-Rb50／CBP。 1.2检测SO-Rb50／CBP的交叉耐药性及生物学特性，并初步探讨其耐药机理。 2.实验方法 2.1 SO-Rb50耐药细胞SO-Rb50／CBP的诱导。 模拟临床化疗周期，采用大剂量冲击用药的方法，经过10个月诱导RB细胞系SO-Rb50成为耐卡铂细胞SO-Rb50／cBP，不断测定用药后细胞对卡铂的IC50值的变化，当RI[RI=IC50(耐药细胞)／IC50(敏感细胞)]大于15时，说明我们已诱导SO-Rb50细胞产生高度耐药性。 2.2细胞形态学观察、生长曲线绘制及群体倍增时间测定将两种细胞按1×105／mL的浓度分别接种于96孔板中，每孔180μL，置于培养箱，每块96孔板设一调零孔，只加工作液。于接种后1，2，3，4，5，6，7天各取出两板，加入MTT20μL／孔，继续培养4h后，离心(2000转／min × 10min)，吸去上清，每孔加二甲基亚砜2001μL，振荡5min，使甲躜颗粒充分溶解。以调零孔校正零点，用Sigma ∑960型酶标仪测定570nto波长下各孔的吸光度值(A570)，用SPSS软件分别绘制两种细胞的生长曲线。 2.3 MTT法分别测定SO-Rb50和SO-Rb50／CBP对顺铂等五种化疗药物的IC50值，计算耐药指数。 2.4 用免疫细胞化学染色方法和流式细胞仪分别检测SO-Rb50和SO-Rb50／CBP的p—gp、MRP、LRP、GST-π蛋白的表达，并比较其差异。 2.5采用半定量RT—PCR检测其多药耐药基因(MDR1)、多药耐药相关蛋白(MRP)基因、肺癌耐药蛋白(LRP)基因、谷胱甘肽S转移酶(6ST-π)基因的表达。 3.结果： 3.1经过十个月的诱导，建立起SO-Rb50的耐药细胞SO-Rb50／CBP，耐药指数为15.7倍。 3.2亲本细胞与耐药细胞群体倍增时间分别是44.32小时和50.9小时。 3.3 SO-Rb50／CBP对CBP，DDP，VCR，MMC，VP-16和5-Fu的耐药指数分别是15.7，6.89，5.68，4.58，2.28和1.88。 3.4 SO-Rb50／CBP的LRP、GST-π蛋白、p—gp和MRP表达的阳性率分别是97.26、96.19、87.67和89.21，亲本细胞四种蛋白的阳性率分别为20.92、20.12、40.33和30.48。 3.5 SO-Rb50和SO-Rb50／CARP均表达MDRI、MRP、LRP及GST-π基因。SO-Rb50／CBP的MDR1、MRP、LRP及GST—π的mRNA表达水平明显增高。 4.结论： 4.1经过10个月的诱导，我们已经诱导SO-Rb50成为耐卡铂的细胞SO-Rb50／CBP。 4.2 SO-Rb50／CBP耐药细胞不仅对卡铂耐药，还对VP-16，MMC，DDP，VCR产生耐药，说明此耐药细胞存在多药耐药现象。 4.3耐药细胞较之亲本细胞P—gp、MRP、LRP、GST-π蛋白及其mRNA的表达均有提高，提示卡铂诱导的耐药现象的产生，与这些耐药蛋白表达的提高有关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要英文缩略词表

声明

引言

第1章实验材料

第2章试验方法

第三章实验结果

第四章讨论

第五章结论

第六章 展望

参考文献

在学期间发表论文

致谢