一种新的尖吻蝮蛇毒类凝血酶FⅧac的分离纯化、生化特征及生物活性研究

摘要

蝮亚科、蝰亚科毒蛇的蛇毒中存在多种可影响凝血和纤溶系统的酶类，其中一种能直接使纤维蛋白原凝集的组分——类凝血酶受到广泛的关注。迄今为止已有40多种类凝血酶的组分被分离纯化，并且其中一些类凝血酶已经发展为临床治疗药物，如Ancrod,Crotalase，Batroxobin以及立止血等，在治疗血栓栓塞性疾病和出血性疾病中获得了良好的疗效。尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)，又称五步蛇，隶属爬行纲(Reptilia)，有鳞目(Squamata)，蝰科(Viperidae)，蝮亚科(Crotalinae)。尖吻蝮蛇毒中富含类凝血酶成分，目前翟宁、肖昌华及潘华等均已报道从五步蛇蛇毒中分离纯化出了类凝血酶的组分，但它们的分子性质各不相同，提示在五步蛇毒中存在多种类凝血酶的组分。目前，临床药物中还没有尖吻蝮蛇毒类凝血酶的止血制剂。尖吻蝮蛇是我国的特有蛇种，资源丰富，开发尖吻蝮蛇毒来源的止血制剂具有广阔的发展前景。 目的： 本文选用了尖吻蝮蛇的蛇毒干粉，试图从中分离纯化出一个新的具有止血应用前景的类凝血酶组分，并研究其理化性质、生物活性等方面的内容。 方法： 1.尖吻蝮蛇毒经过DEAE-Sephadex A-50离子交换层析，SuperdextmG-75分子凝胶过滤层析及Benzamidine Sepharose CL-6B亲和凝胶层析三步分离纯化； 2.SDS-PAGE鉴定其纯度； 3.质谱MALDI-TOF-TOF-MS测定分子量； 4.等电聚焦电泳测定等电点； 5.用Ouyang和Teng的方法检测FⅧac降解纤维蛋白原的作用； 6.用纤维蛋白平板法测定FⅧac对纤维蛋白的降解作用； 7.用李书宽的方法检测FⅧac的精氨酸酯酶活性； 8.用Naha和Sorrentuno的方法检测FⅧac体外凝血活性，并用Francis SM等的方法测定FⅧac的凝血酶比活；用特异性底物法研究FⅧac对凝血因子X、凝血酶原的激活作用，用尿素法研究FⅧac对凝血因子XⅢ的激活作用； 9.以纤维蛋白原为底物，用反应板法测定温度、pH、金属离子以及抑制剂对FⅧac酶活性影响； 10.FⅧac通过SDS-PAGE转至PVDF膜，采用Edman降解法测定其N端序列。 结果： 1.尖吻蝮蛇毒粗毒经过DEAE-Sephadex A-50离子交换层析，SuperdexTM G-75分子凝胶过滤层析及Benzamidine Sepharose CL-6B亲和凝胶层析三步分离纯化后，分离得到一个具有凝血活性的组分(FⅧac)，该蛋白为单链蛋白质，分子量为31600.925 Da，等电点为4.6； 2.FⅧac可水解人和牛纤维蛋白原的Aα链，长时间作用(24h)可水解人纤维蛋白原的Bβ链，对牛纤维蛋白原Bβ链无作用，对γ链无作用，且降解纤维蛋白原有剂量、时间依赖性；FⅧac对纤维蛋白无降解作用；测得FⅧac的精氨酸酯酶活力为33.3±12.8U／mg； 3.FⅧac可剂量依赖性促使血浆和纤维蛋白原凝固；对凝血因子XⅢ、凝血因子X、凝血酶原无激活作用； 4.FⅧac的适宜pH为7-10，适宜温度为25-60℃；FⅧac的活性可被PMSF和Aprotinin抑制； 5.FⅧac的N端序列为NH2-V-I-G-G-V-E-C-D-I-N。 小结： 1.尖吻蝮蛇毒毒经过DEAE-Sephadex A-50离子交换层析，SuperdexTM G-75分子凝胶过滤层析及Benzamidine Sepharose CL-6B亲和凝胶层析分离纯化，得到一个具有凝血活性的组分(FⅧac)；FⅧac可剂量依赖性促使血浆和纤维蛋白原凝固；不激活其他凝血因子，并且具有精氨酸酯酶活性，提示FⅧac是一种类凝血酶； 2.FⅧac为单链丝氨酸蛋白酶，分子量为31600.925 Da，等电点为4.6，N端序列为NH2-V-I-G-G-V-E-C-D-I-N；FⅧac可水解人和牛纤维蛋白原的Aα链，长时间作用(24h)可水解人纤维蛋白原的Bβ链，对两者γ链无作用，对纤维蛋白无降解作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章前言

第2章实验材料和方法

2.1实验材料

2.2实验方法

第3章实验结果

3.1尖吻蝮蛇毒类凝血酶组分(FⅧac)的分离纯化

3.2 FⅧac分子性质分析

3.3 FⅧac降解纤维蛋白(原)活性的分析

3.4 FⅧac体外凝血活性

3.5FVⅢac的精氛酸酯酶活性测定

3.6 FⅧac的酶学研究

3.7 FⅧac的N端测序

第4章讨论

4.1尖吻蝮蛇类凝血酶(FⅧac)的分离纯化

4.2尖吻蝮蛇类凝血酶(FⅧac)的纤维蛋白（原）水解活性及机制分析

4.3尖吻蝮蛇类凝血酶(FⅧac)促凝活性的研究

4.4尖吻蝮蛇类凝血酶(FⅧac)的酶的活性特征研究

4.5 FⅧac的N端测序

第5章小结

参考文献

附 录

致 谢