脑死亡供肝的临床应用及改善脑死亡供肝质量的实验研究

摘要

我国每年因终末期肝病需行肝移植的人数约30万人，远远超过捐献肝脏的数量，只有不到1％的患者能得到肝脏以挽救生命，大量终末期肝病病人在等待肝移植过程死亡，而且器官短缺的形势日益严峻。积极推动脑死亡供体来源器官的使用是目前解决我国供体器官短缺的最有前景的方案，我国具有大量的脑死亡患者，据统计，每年仅因车祸死亡的人数高达13万人，因各种疾病在医院处于脑死亡状态的患者数目更加庞大，为拓展供体器官来源的渠道，有关BDD作为临床器官移植来源的研究将成为我国移植领域研究的热点，具有极大的临床应用前景。然而，我国目前缺乏脑死亡相关立法，脑死亡观念尚未被国人广泛接受，不仅公众对BDD器官捐献的意识非常薄弱，医护人员对脑死亡意识也远远不够。而且受总体医疗水平限制，众多基层医院缺乏脑死亡诊断和处理的一般技术经验。迄今为止，目前国内BD患者所捐赠的器官成功用于器官移植者仅100余例，而应用于肝移植的成功病例更是屈指可数。 脑死亡作为一个严重复杂的病理过程，对机体的各个器官均有严重的损害。正因为脑死亡状态下，各器官功能均受到影响，人们尝试应用药物对BDD进行干预治疗以稳定或逆转BDD的病理生理状态，改善死亡供体器官功能，逆转受损器官，改善移植患者预后，因此BDD维护对于改善BDD器官质量具有重要意义。即使在西方发达国家，仍有约25％的潜在BDD在维护过程中丢失，积极的维护措施有助于稳定BDD的生理状态、减少潜在供体器官的丢失、逆转不稳定器官功能使之适用于移植。不少临床及实验研究认为前列腺素E1具有非常显著的保护肝脏的作用，它在肝移植领域的应用也非常广泛，包括移植后肝功能衰竭、肝功能恢复不良、排斥反应、各种血管并发症引起的肝功能损害，活体肝移植术后的小肝综合征等等，对于无心跳供体来源的肝脏，使用PGE1亦能减轻缺血再灌注损伤。但PGE1在BDD维护中的使用未见有报道。 本课题比较BDD和传统的NHBD来源供肝对肝移植术后患者及移植物预后的影响，初步分析BDD来源供肝应用于临床的安全性，总结使用BDD来源供肝肝移植的临床经验；通过建立稳定的大鼠渐进性脑死亡模型，研究PGE1对于脑死亡状态下供肝的保护作用并探讨其相关机制。 第一部分脑死亡供体来源供肝临床应用的初步研究 目的：初步分析BDD来源供肝应用于临床的安全性，比较BDD和传统的NHBD来源供肝对肝移植术后患者及移植物预后的影响，总结使用BDD来源供肝肝移植的临床经验。 方法：2006年1月至2007年12月中山大学附属一院器官移植科共实施成人首次全肝移植130例，其中9例接受脑死亡供体供肝(BDD组)，121例接受无心跳供体供肝(NHBD组)。BDD组9例脑死亡供体年龄16～43y，7例因颅脑外伤死亡，2例因脑血管意外死亡，器官切取前平均动脉压105±5.2mmHg(6例需使用升压药物)，肝功能检测AST175±40U/L，ALT180±46U/L，TBi140±8.6mmol/L。BDD组受者年龄48.6±10.1岁，男性8例，女性1例，术前诊断为肝硬化5例，HCC4例，术前MELD评分27.6±6.7；NHBD组男性110例，女性11例，年龄44.6±16.1岁，术前诊断为肝硬化61例，HCC51例，其他9例，术前MELD评分为26.2±5.6。比较两组患者术中出血量、手术时间、无肝期时间、术后SICU治疗时间、肝功能恢复情况、各种并发症的发生率及术后近期生存情况(围手术期、术后6月及术后12月生存率)的差异。 结果：所有患者均手术成功，两组患者手术中无肝期时间、手术时间、术中出血量及术中输血量均无明显差异。两组患者手术后肝功能恢复的趋势一致，手术后ICU治疗时间、凝血功能恢复正常时间、肝、肾功能恢复正常时间及手术后住院时间无明显差异。截止至2008年12月，BDD组受者随访7d～32月，共有2例患者死亡，其中1例术后7d死于急性肾功能衰竭(acute renal failure，ARF)，1例术后24月死于肿瘤复发，其他并发症包括急性排斥反应2例，胆道狭窄并感染1例，胆道缺血1例，肺部感染1例。NHBD组共有17例患者死亡，其中手术后1月内死亡5例，死因分别为肾功能衰竭、严重感染(3例)及颅内出血，1例术后2月因移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)并发严重感染死亡，1例术后8月死于巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)感染、5例因胆道并发症分别于术后5、6、10、11、19月死亡，5例因肝癌复发于术后14、20、22、26、31月死亡。BDD组围手术期生存率为88.8％(8/9)，术后6月生存率为88.8％(8/9)，术后12月生存率为88.8％(8/9)，NHBD组围手术期生存率为95.8％(116/121)，术后6月生存率为93.4％(113/121)，术后12月生存率为90.9％(110/121)。两组患者相比较，围手术期生存率(χ2=0.927，P=0.356)、术后6月(χ2=0.263，P=0.487)及12月生存率(χ2=0.248，P=0.618)无明显差异，根据Kaplan—Meier法作出两组患者术后生存曲线，long—rank法显示组间比较无显著性差异(χ2=0.176，P=0.675)。术后常见并发症的发生率也无明显差异。 结论：BDD来源的供肝与NHBD来源的供肝相比，移植肝及受者术后近、中期预后无明显差异。只要筛选严格，目前国内BDD来源的供肝适用于肝脏移植，是解决目前供肝短缺难题的有效办法，具有极大的临床应用前景。 第二部分 PGE1改善脑死亡供肝质量的实验研究 目的：通过建立稳定的大鼠渐进性脑死亡模型，研究在脑死亡大鼠中使用PGE1能否改善供肝质量并探讨其相关机制。 方法：建立渐进性脑死亡大鼠模型，在大鼠颅骨矢状线外侧0.2～0.5cm处钻一个1mm的孔，一根3号Fogarty导管由此置入颅内，尖端指向脑干。向导管气囊内以每min10μl的速度注入生理盐水，逐渐膨胀气囊，增加颅内压，直到出现脑干疝。脑死亡的诊断通过记录静息脑电图、有无角膜反射及呼吸停止试验来证实。60只大鼠根据以下处理分为三组，每组20只：BD组：仅诱导脑死亡，经尾静脉微输液泵输入乳酸林格氏液0.5ml/h，PGE1组：脑死亡诱导后，将PGE1注射液(凯时，10μg/支)以0.05μg/(kg—min)速度持续性泵入。空白对照组：仅麻醉，不诱导脑死亡。以上各组在BD诱导后的2h和4h各取10只，分别采血及获取肝脏标本。比较各组大鼠血流动力学指标，包括心率(heart rate，HR)，平均动脉压(mean arterialpressure，MAP)的变化；肝酶学指标AST，ALT；ELISA法测定血清透明质酸(hyaluronic acid，HA)；透射电镜观察肝组织微结构变化；高碘酸—无色品红法显示糖原(PAS反应)、镁激活法显示三磷酸腺苷酶(Mg2+—ATPase)作为肝脏能量代谢指标。脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal—deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)法检测各组肝细胞凋亡情况，并比较各组凋亡指数(apoptosis index，AI)。 结果：诱导脑死亡过程中，BD组与PGE1组大鼠MAP、HR变化趋势一致，两组间无明显差异，BD诱导4h后大鼠逐渐出现循环不稳定。脑死亡2h，对照组、BD组及PGE1组大鼠ALT分别为46.0±12.0、90.3±32.5及76.2±26.8U/L，AST分别为100.4±15.6、220.6±40.8及160.6±32.4U/L，PGE1治疗组与BD组较对照组肝酶明显升高，但两组间比较无明显差异。脑死亡4h，各组ALT为48.2±12.6、210.6±42.8和156.5±33.6U/L，AST为116.5±18.2、310.6±60.8和226.8±45.4U/L，BD大鼠的肝功能损伤进一步加重，PGE1组较BD组有明显改善。诱导BD后，大鼠肝细胞内糖原及Mg2+—ATPase酶化学活性减弱，PGE1处理后肝细胞内糖原及Mg2+—ATPase酶化学活性增强。脑死亡诱导后2h，各组大鼠血清中HA的含量为63.7±13.1、150.3±22.7及116.2±15.8μg/L；4h，各组HA为69.5±13.4，238.6±42.8及149.5±33.6μg/L，脑死亡诱导后，HA升高提示肝脏微循环障碍，PGE1组较BD组明显降低(P<0.05)。脑死亡后，透射电镜显示肝细胞及肝窦内皮细胞的超微结构受损，Kupffer细胞活化，PGE1可减轻大鼠肝脏超微结构的损伤并抑制Kupffer细胞活化。脑死亡诱导后2h，各组大鼠肝脏AI分别为1.2±0.4％，8.3±3.7％及5.2±2.8％；4h后，AI分别为1.5±0.4％、13.6±4.8％和9.5±3.6％，脑死亡后，大鼠肝脏凋亡细胞数量明显增加，且随脑死亡时间的延长而增加，PGE1可以减少BD大鼠肝细胞的凋亡。 结论：PGE1能改善脑死亡大鼠的肝功能，其作用机理可能在于改善大鼠肝脏微循环和肝细胞的能量代谢，抑制肝脏Kufpper细胞的活化及肝细胞的凋亡。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

第一部分 脑死亡供体来源供肝临床应用的初步研究

序 言

资料和方法

结 果

讨 论

结 论

参考文献

附 图

附 录

第二部分 PGE1改善脑死亡供肝质量的实验研究

序言

材料和方法

结 果

讨 论

结 论

参考文献

附 图

综述一 脑死亡供体的维护对改善脑死亡器官质量的意义

综述二 供肝短缺形势下的肝脏移植

攻读学位期间主要的研究成果

致 谢