鱼类kisspeptin与gnih信号系统的鉴定及其在生殖调控中的作用研究

摘要

神经内分泌因子，Kisspeptin与GnIH(gonadotropin-inhibitory hormone)对哺乳动物的生殖轴起着直接而相反的调控作用，Kisspeptin通过刺激下丘脑GnRH的分泌，从而促进脑垂体GtH的合成与释放，而GnIH则直接或通过GnRH抑制GtH的合成与释放。本文利用比较基因组学技术，结合分子生物学手段，在斑马鱼(Danio rerio)、金鱼(Carassius auratus)中鉴定了kisspeptin/gpr54与gnih/gnihr信号系统，研究了它们在青春期启动、GtH分泌、性类固醇激素反馈调控方面的作用，并检测kisspeptin及其类似物对鱼类催产的效果。主要研究结果如下：
　　 ⑴与哺乳类不同，在鱼类中存在2种kisspeptin(kiss1、kiss2)与2种gpr54(gpr54a、gpr54b)基因。通过基因共线性分析：鱼类的2种kiss来源于一个共同的祖先基因，在脊椎动物发生早期，通过基因组或者染色体片段的复制而形成，经过漫长的生物进化，在高等哺乳动物中已经丢失了kiss2基因，而在鱼类仍然保留着两个kisspeptin基因。为了进一步研究它们的功能，我们在金鱼中克隆了kiss1、kiss2以及它们的受体gpr54a、gpr54b基因的cDNA全长序列。组织分布显示：kiss1、kiss2、gpr54a、gpr54b在金鱼生殖相关组织或区域(下丘脑、垂体、性腺)均有丰富的表达，提示kisspeptins可能参与鱼类的生殖调控。通过配体受体结合实验，证实了两种kisspeptins均能结合gpr54s(gpr54a、gpr54b)，启动下游信号通路，但存在一定的配体-受体选择性差异。
　　 ⑵通过同源比对搜索，在硬骨鱼类的基因组数据库中发现了GnIH的同源基因。同线性分析表明，gnih基因在鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类都维持着保守的同线性结构；根据预测出来的序列，我们在斑马鱼中克隆了gnih基因以及三个潜在的gnih受体基因(gnihr1、gnihr2、gnihr3)的cDNA序列全长。同源比对结果显示：GnIH的氨基酸序列在不同物种中存在较大的差异。GnIH受体的序列同源比对和进化树分析都表明斑马鱼三个gnihrs属于gnih的受体。组织表达模式研究显示：gnih与gnihrs主要在斑马鱼脑中表达，提示它们的作用区域主要在脑区。此外，我们还研究了gnih与gnihrs在斑马鱼胚胎发育过程的表达变化。gnih的表达在5-原基期首次被检测到，之后一直维持在相对恒定的水平；而三个gnihrs在整个胚胎和早期发育过程都有表达。
　　 ⑶运用realtime-PCR方法，我们检测了kisses、gpr54s、gnih与gnihrs在斑马鱼青春期发育过程中的表达变化。两个kiss基因在青春期启动前表达开始上升，但它们的表达模式又有所不同；而两个gpr54s的表达模式呈现互补的趋势；提示它们在青春期发育的过程中可能具有不同的功能。gnih与gnihr1的表达在斑马鱼青春期发育过程中没有显著变化，而gnihr2、gnihr3在卵黄生成中期显著升高，其中的分子机制目前还不是很了解。
　　 ⑷通过化学合成金鱼kisspeptins与斑马鱼gnih的核心肽，在体注射成熟的雌性金鱼，发现kiss1能显著刺激金鱼LH的分泌，而kiss2不能；在较高剂量，gnih亦能有效地抑制金鱼LH的分泌。然而，在离体实验中，2种kisspeptin与gnih对金鱼垂体细胞LH的分泌均没有显著的影响，提示kisspeptins与gnih对金鱼的LH调控可能发生在下丘脑水平。
　　 ⑸通过切除金鱼的卵巢，运用realtime-PCR检测下丘脑kiss1、kiss2与gnih的表达。研究发现：卵巢切除后下丘脑kiss1基因的表达没有显著性的变化；kiss2的表达则升高了，在雌激素补偿后有所降低；gnih在卵巢切除后，表达量下降，在雌激素补偿后，恢复到对照组的水平。提示性类固醇激素对金鱼下丘脑的kiss2具有负反馈调控作用，对gnih具有正反馈调控作用。
　　 ⑹用kisspeptin和kisspeptin类似物对金鱼、鲫鱼、泥鳅进行催产检测，发现它们具有一定的催产效果，但是催产率不高。

目录

文摘

英文文摘

声明

绪论

1 Kisspeptin/GPR54信号系统的研究进展

2 GnIH/GnIHR的研究进展

3研究的主要目的和意义

4特色和创新点

第1章 金鱼kisspeptin/gpr54信号系统的鉴定

前言

第一节 鱼类kisspeptin基因的信息生物学鉴定

第二节 金鱼kiss1、kiss2及gpr54a、gpr54b基因cDNA的克隆及其序列分

第三节 金鱼kiss1、kiss2及gpr4a、gpr54b基因的组织表达模式分析

第四节 金鱼kiss1、kiss2与gpr54a、gpr54b的结合分析

3讨论

第二章 斑马鱼gnih/gnihr信号系统的鉴定

前言

第一节 斑马鱼gnih基因的同线性分析与cDNA克隆

第二节 斑马鱼gnihr基因的cDNA克隆与序列分析

第三节 斑马鱼gnih、gnihrs的组织表达模式与早期发育表达模式分析

讨论

第三章 kisspeptin/gpr54、gnih/gnihr在斑马鱼青春期启动过程中的作用研究

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

第四章 kisspeptin、gnih对金鱼GtH释放的调控研究

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

第五章 性类固醇激素对kiss1、kiss2、gnih的反馈调节研究

前言

1材料方法

2结果

3讨论

第六章 kisspeptin对鱼类的催产效果及其类似物设计的探索

1.金鱼的催产实验

2.鲫鱼的催产实验

3.泥鳅的催产实验

4结果与讨论

总结与展望

参考文献

附录

感言