狄斯瓦螨(Varroa destructor)诱导中华蜜蜂(Apis cerana)和意大利蜜蜂(A.mellifera)差异基因表达及相关基因的沉默

摘要

狄斯瓦螨(Varroa destructor，简称大蜂螨)是威胁世界养蜂业最大的蜜蜂病害。目前，防治大蜂螨主要采用化学药物，这导致了蜂产品的严重污染和蜂螨抗药性问题。养蜂业期待环境友好的蜜蜂螨害防治新技术。意蜂(Apis mellifera)对狄斯瓦螨极为敏感，而中华蜜蜂(Apis cerana)(狄斯瓦螨的原始寄主)对这一害螨具有抗性。目前，中华蜜蜂耐受狄斯瓦螨的分子机制还未明了。探讨这些机制可能有利于运用新的分子生物学手段防治狄斯瓦螨和培育新的抗螨蜂品种。为此，本论文采用抑制性消减杂交方法(suppression subtractive hybridization，SSH)构建狄斯瓦螨诱导中蜂和意蜂的基因差异表达文库，分析相关差异表达基因，并应用RNAi方法研究狄斯瓦螨诱导的相关中蜂和意蜂基因，为阐明中蜂的抗螨机制和防治意蜂螨害提供线索。
　　 本论文利用SSH技术分别建立狄斯瓦螨诱导下的中蜂和意蜂差异基因表达文库，共获得2640个克隆子。经过dot blot筛选及序列分析，得到289个有效基因序列，序列组装分析结果表明，有26个重叠群(contig)和106个单拷贝基因(singlet)，代表了共计132个独立基因(unigene)，其中中蜂文库49个差异基因、意蜂文库83个差异基因。经BLAST分析，有85％的序列与已知基因具有同源性，15％的序列为未知基因。经过基因注释分析(Gene OntlologyAnnotation)，51个基因有详细的注释，根据分子功能和生物过程分类，所注释基因可归为16个分子功能类和14个生物过程类。另外，使用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术进一步验证了8个差异表达基因的表达模式，说明SSH方法是筛选差异表达基因的有效方法，所得差异基因都是真实可靠的。比较两对文库的差异表达基因，发现中蜂和意蜂的差异基因大多数是不同的，除了Npv-r在两种蜜蜂被狄斯瓦螨侵染后都下调，hex110在中蜂中上调但在意蜂中为下调。这些差异基因大部分都是参与代谢过程和神经信号传导过程。研究结果提供了中蜂和意蜂蜜蜂应答瓦螨侵染在分子水平上的信息，但是所得基因功能还需进一步研究。
　　 本论文还利用RNAi技术试图沉默三个与狄斯瓦螨诱导相关的中蜂基因(hex110,para，defensin)，为证明其是否与蜜蜂的抗螨作用有关提供实验方法。首先建立中蜂幼虫的实验室饲养体系，采用喂食的方法将上述三个基因不同片段dsRNA导入3龄中蜂幼虫；针对defensin基因设置了3个dsRNA-defensin浓度(1μg/头/天、3μg/头/天和5μg/头/天)，持续喂食三天后，发现在中蜂的预蛹、白眼蛹和褐眼蛹中靶标基因defensin的转录水平被特异性抑制，但各浓度之间没有显著性差异；取食含有不同浓度dsRNA-defensin后，中蜂幼虫存活率分别为73％、83％和87％，与对照相比显著升高；羽化率分别是27％、44％和27％，与对照相比，仅饲喂3μg/头/天的处理组显著升高。结果表明，饲喂dsRNA-defensin影响靶标基因的转录、中蜂幼虫的存活率及蛹的羽化率。然而，以hex110和para合成的不同dsRNA片段分别持续饲喂中蜂3龄幼虫三天后(1μg/头/天)，中蜂预蛹中靶标基因未观察到被沉默。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1蜜蜂概述

1.2狄斯瓦螨的危害及其防治

1.2.1蜜蜂寄生螨类的分类

1.2.2狄斯瓦螨的生物学特性

1.2.3狄斯瓦螨的危害

1.2.4狄斯瓦螨的防治

1.3中华蜜蜂的抗螨机制

1.3.1清理行为

1.3.2移走和埋葬

1.3.3封盖期长短不同

1.3.4铜元素和保幼激素的差异

1.4差异表达基因的筛选及抑制性消减杂交技术的应用

1.4.1差异表达基因筛选方法回顾

1.4.2抑制性消减杂交法(SSH)

1.4.3抑制性消减杂交在分离昆虫差异表达基因中的应用的应用

1.5实时定量PCR

1.5.1实时荧光定量PCR定义

1.5.2实时荧光定量PCR原理

1.5.3荧光化学

1.5.4定量方法

1.6 RNAi的概况

1.6.1 RNAi的作用机制

1.6.2 RNAi的运用

1.7本论文研究的目的与内容

1.7.1研究目的

1.7.2研究内容

第二章狄斯瓦螨基因型的鉴定

2.1材科

2.1.1样品的采集

2.1.2主要仪器设备

2.1.3主要试剂

2.2技术路线

2.3方法

2.3.1 DNA的提取

2.3.2使用的引物

2.3.3 PCR扩增mtDNA COI的片段

2.3.4 DNA的凝胶回收

2.3.5序列测定及分析

2.4结果与分析

2.4.1 PCR扩增狄斯瓦螨mtDNA COI

2.4.2序列分析

2.5讨论

第三章狄斯瓦螨侵染蜜蜂差异表达基因文库的构建与差异基因分析

3.1实验材料

3.1.1主要仪器设备

3.1.2主要试剂

3.1.3试剂的配制

3.2技术路线

3.3实验方法

3.3.1样品病毒检测

3.3.2狄斯瓦螨(V.destructor)侵染时间的确定

3.3.3狄斯瓦螨侵染蜜蜂样品的制备

3.3.4狄斯瓦螨侵染中蜂差异表达消减文库的构建

3.3.5消减cDNA质粒文库的构建

3.3.6 Dot blot筛选差异表达基因

3.3.7阳性克隆cDNA片段测序及序列分析

3.3.8 qRT-PCR验证差异基因

3.4实验结果

3.4.1中蜂和意蜂tRNAleu与COII间隔区扩增与鉴定

3.4.2最佳侵染时间的确定

3.4.3构建狄斯瓦螨侵染中蜂差异表达基因文库

3.4.4斑点杂交分析

3.4.5序列分析

3.4.6基因功能注释(Gene Ontology)

3.4.7 qRT-PCR验证差异表达基因

3.5讨论

3.5.1文库概述

3.5.2在中蜂中差异表达的基因

3.5.3在意蜂中差异表达的基因

3.5.4 qRT-PCR分析

第四章与狄斯瓦螨相关的蜜蜂基因沉默

4.1实验材料

4.1.1主要仪器设备

4.1.2实验动物

4.1.3主要试剂

4.2技术路线

4.3实验方法

4.3.1蜜蜂幼虫室内培养系统的建立

4.3.2数据分析

4.3.3 dsRNA的制备

4.3.4 dsRNA-defensin不同喂食浓度对基因沉默的影响

4.3.5 dsRNA-para不同片段对基因沉默的影响

4.3.6 dsRNA-hex110不同片段对基因沉默的影响

4.4实验结果

4.4.1蜜蜂幼虫室内培养系统的建立

4.4.2 dsRNA的合成

4.4.3饲喂不同浓度的dsRNA-defensin对中蜂defensin mRNA表达水平的影响

4.4.4饲喂dsRNA-para对中蜂para mRNA表达水平的影响

4.4.5饲喂dsRNA-hex110对中蜂hex110 mRNA表达水平的影响

4.5讨论

结论与展望

结论

本论文创新之处

展望

参考文献

在读期间发表论文

致谢