大鼠急性脊髓损伤后垂体腺苷酸环化酶激活肽的表达及意义

摘要

研究背景:脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是一种严重的神经系统创伤,目前脊髓损伤修复的两大难题:(1)如何预防脊髓损伤引起的神经细胞死亡,以及如何替代已死亡的神经细胞;(2)如何抑制损伤局部疤痕形成,创造适合神经再生的微环境促进诱导神经生长。传统观点认为,哺乳动物中枢神经系统损伤后,神经细胞不能再生,因为成熟的神经细胞是不能分裂的,损伤后神经细胞只能被胶质细胞所填充而形成胶质瘢痕。然而,近年来的研究发现,成年动物脊髓损伤后,可以有不同程度的恢复,在适当的生长环境下,成熟哺乳动物中枢神经系统内的一些受损的神经元的轴突能有少许再生,并能与靶细胞形成功能性的突触联系,而一些未成熟哺乳动物SCI后能轴突再生和功能恢复,进一步研究发现神经营养因子能促进神经元再生从而促进SCI修复。垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP)是从羊下丘脑中分离出来的一种能够激活培养的大鼠垂体细胞腺苷酸环化酶活性的神经肽,属于分泌素、胰高血糖素、血管活性肠肽和生长激素释放激素家族。近年来PACAP被认为是一种新的神经营养因子,目前已证实PACAP具有神经递质、神经调质、神经营养等功能,可以在神经组织受到损伤时由肽能神经元分泌产生,有助于神经损伤组织的自身修复。而且由于PACAP分子质量小,能够完整地透过血脑屏障,用于中枢神经损伤的治疗具有给药途径方便的潜在优势。
　　目的:通过制备大鼠SCI模型,研究大鼠脊髓损伤后PACAP表达的变化,为进一步探索脊髓损伤后的再生修复机制和神经营养因子治疗脊髓损伤提供实验依据。
　　方法:成年雌性SD大鼠84只,体重180~220g(南方医科大学动物中心提供),随机分为损伤后1,3,7,14,28d组以及正常对照组(不做手术),每组14只。所有动物在1％戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔麻醉后,行背中段正中切口,范围 T9~11,采用改良 NYU撞击装置,撞击T10节段制备大鼠中度SCI模型,于术后1、3、7、14、28d取材,制作石蜡组织切片行HE染色及PACAP免疫组化染色(n=5),制作电镜超薄切片透射电镜观察组织超微结构变化及PACAP的细胞定位(n=3),提取损伤脊髓组织总RNA及总蛋白采用RT-PCR(n=3)和western blot(n=3)方法对脊髓组织中PACAP mRNA及蛋白的表达情况进行半定量观察。
　　结果:1.脊髓损伤区的组织病理学改变:光镜下见损伤后大鼠脊髓灰质有大片坏死及出血坏死后形成的囊腔,神经细胞肿胀、部分神经细胞的细胞核固缩,白质疏松水肿,空泡变性,部分神经纤维溶解消失,炎症细胞大量浸润,随着损伤时间延长有所好转。
　　2.免疫组织化学观察:PACAP阳性反应位于细胞膜和细胞浆,对照组神经元中有少量PACAP阳性表达,损伤后PACAP的表达逐渐增高,损伤7d时PACAP表达明显增加(P<0.05),至28d时表达仍较高。
　　3.RT-PCR和western blot检测:在蛋白和mRNA水平PACAP表达趋势一致,正常对照组可见PACAP mRNA和蛋白的少量表达,脊髓损伤后1d表达开始增加,7d时表达明显增加,与3 d时比较差异有显著性意义(P<0.05)。
　　4.透射电镜及免疫电镜观察:SCI后脊髓髓鞘板层结构松解,轴索中微丝、微管排列不整或消失,神经元细胞膜、核膜不整齐,游离核糖体增多,线粒体和粗面内质网呈不同程度的肿胀、空泡变性,嵴溶解断裂。胶体金标记免疫电镜观察显示SCI后1d PACAP抗原位于神经元胞浆及部分神经纤维中,散在分布。
　　结论:损伤后PACAP表达增加,内源性PACAP的增加可能有利于受损脊髓神经元的存活与再生,作为神经营养因子,PACAP的表达可能与机体自身修复有关。

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缩写词表

前言

材料与方法

结果

1. HE染色组织病理学结果

2.免疫组化结果

3. RT-PCR结果

4. Western Blot结果

5.电镜及免疫电镜结果

讨论

1.动物模型的制备及SCI病理变化

2.神经营养因子的作用

3.PACAP的神经保护作用

4.前景展望

结论

参考文献

文献综述

附录1 主要实验试剂配制

附录2 技术路线

个人简历

硕士期间发表论文

致谢