基于促融性病毒糖蛋白VSV-G和红细胞血影的新型DNA递送技术研究

摘要

背景：无论是对遗传性缺陷还是获得性疾病，基因治疗法都具有极大的吸引力。然而，缺乏安全、有效的基因递送系统严重限制了基因疗法在临床上的应用。红细胞血影由于其优越的生物相容性而被广泛应用于药物投递，但大分子DNA的包被问题仍是一项艰巨挑战。口炎病毒糖蛋白VSV-G在内含体酸性条件下促进膜融合，从而将病毒基因组释放到宿主细胞的胞浆。
　　目的：本研究的目的是利用红细胞血影生物相容性和VSV-G糖蛋白的促融性，组装成一种新型的病毒体DNA递送系统。另外，为实现规模化生产此病毒体递送系统，本研究还尝试利用毕赤酵母表达和制备病毒糖蛋白VSV-G。
　　方法：收集表达VSV-G基因的AD293细胞条件培养液（CM），低渗裂解法制备红细胞血影（EG），酸性条件下静置孵育促使VSV-G整合到EG表面，包被浓缩的DNA从而获得病毒体，然后用Western印迹、荧光免疫染色、扫描电镜检测等技术进行表征，通过流式细胞术和荧光素酶活性分析，评估病毒体在不同动物细胞中的转染效率，最后利用共聚焦显微技术分析EG的内吞情况。将 VSV-G基因片段插入 pPIC3.5K毕赤酵母表达质粒，线性化后电转化KM71毕赤酵母菌株，在组氨酸缺乏的 MD平板和 G418筛选含高拷贝 VSV-G基因的酵母克隆KM71/VSV-G，通过1％甲醇诱导发酵，制备含VSV-G蛋白的酵母裂解上清。以PCR及Western印迹检测VSV-G基因及蛋白水平，利用荧光免疫染色、蛋白质转移实验、和DNA转染实验检测VSV-G蛋白的生物活性。
　　结果：48小时的CM较24小时的CM含有更多VSV-G蛋白。孵育后VSV-G蛋白以颗粒形式结合在EG表面，DNA/PEI复合物形成100-300nm颗粒，其中约60%的复合物结合在 EG表面，未能进入 EG内部。添加 EG后，pGL3-control荧光素酶表达质粒在AD293细胞的表达活性提高2倍，添加CM则提高6倍，而添加EG与CM则提高约7倍。添加在酸性条件下制备的EG/VSV-G，发现荧光素酶的活性可在原基础上再提高约4倍。用红色荧光蛋白表达载体pCMV-DsRed转染AD293细胞， DsRed阳性细胞的比例在EG/VSV-G存在时从55%提高至80%，荧光强度也有显著加强。用 pCMV-DsRed转染通常条件下难以转染的动物细胞，包括3T3细胞、小鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）、HeLa细胞和胰岛Beta细胞INS-1，添加EG/VSV-G可将转染效率提高2-3倍。将EG用携带绿色荧光的葡聚糖标记，孵育10h已观测到EG内吞，20h则有大量的EG被内吞。
　　本研究筛选到3株表达VSV-G的酵母细胞株KM71-VSV-G，在无甲醇存在情况下细胞生长与对照无差别，而在甲醇诱导下，三株细胞的生长速度受到显著抑制，表明VSV-G的表达可能具有一定的细胞毒性。大部分VSV-G蛋白分布在细胞膜上，且甲醇诱导96h后VSV-G蛋白产量最高，少量VSV-G蛋白可在酵母原生质体的CM中检测到。将KM71-VSV-G裂解液添加至AD293细胞，3h后发现VSV-G已整合到AD293细胞，并导致部分细胞融合。将AD293细胞分别转染DNA重组酶表达质粒pCAG-CreER和报告质粒pCMV-DsRed/loxP2-EGFP，然后将两种细胞以1:1比例混合培养，结果发现，只有添加VSV-G裂解液和他莫昔芬才可诱导细胞表达绿色荧光蛋白。用 pGL3-control转染 AD293细胞和HeLa细胞，添加VSV-G裂解液后荧光素酶活性提高3倍左右。用pCMV-DsRed质粒转染细胞，添加VSV-G裂解液可将DsRed阳性的AD293细胞比例从57%提高到65%，而阳性HeLa细胞的比例从5%提高到12%。
　　结论：本研究成功组装了一种基于红细胞血影和口炎病毒糖蛋白VSV-G的病毒体，该病毒体具有较低的细胞毒性和较高的基因投递能力。本研究还构建了VSV-G基因的毕赤酵母表达系统，所产VSV-G蛋白具有良好的生物活性。

目录

英语缩略词

第一章 绪论

1 基因治疗概述

2 基因治疗载体概述

第二章 促融蛋白VSV-G对红细胞载体递送的研究

前言

1 口炎性病毒糖蛋白

2 红细胞载体系统概述

3 试剂与材料

4 方法

5 结果

6 总结

第三章 VSV-G在毕赤酵母表达系统中的表达及功能研究

前言

1 外源蛋白表达系统

2 口炎性病毒糖蛋白（VSV-G）的表达

3 试剂与材料

4 方法

5 结果

6总结

第四章 讨论与结论

1 红细胞装载DNA

2 VSV-G与红细胞膜的整合

3 DNA的递送

4 VSV-G在毕赤酵母中的表达

第五章 展望

1 创新性

2 展望

参考文献

附录Ⅰ 主要试剂配制

附录Ⅱ 质粒及表达载体

附录Ⅲ Markers

致谢

在校期间科研情况

个人简历