钙拮抗剂通过调控MIF的表达拮抗大鼠心肌缺血/再灌注损伤和H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的研究

摘要

心肌缺血/再灌注（Ischemia/Reperfusion，I/R）损伤，是指心肌组织缺血后血流重新恢复，组织的损伤程度较缺血时进一步加重、器官功能进一步恶化的现象。钙拮抗剂通过阻断钙离子通道，抑制细胞外 Ca2+内流，拮抗钙超载从而保护心肌损伤。研究表明，钙拮抗剂除了阻断L-型电压依赖性钙离子通道（L-type voltage dependent calcium channel， L-VDCC）发挥抗心肌I/R损伤的效应之外，其心肌保护效应还可能存在非L-VDCC依赖机制。本课题组前期研究表明，临床常用钙拮抗剂维拉帕米(verapamil，Ver)、硝苯地平(nifedipine，Nif)与碘化N-正丁基氟哌啶醇(N-n-butyl haloperidol iodide，F2，我实验室合成的新型结构钙拮抗剂，图1)在心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)模型上，可通过非L-VDCC途径拮抗心肌细胞H/R损伤。
　　目的：
　　探讨钙拮抗剂不影响钙通道阻断所致血液动力学变化的剂量，对心肌 I/R损伤和 MIF表达的影响。在此基础上，进一步在无钙液培养的H9c2心肌细胞上观察钙拮抗剂对H/R损伤的影响，确认钙拮抗剂的非L-VDCC依赖机制。
　　方法：
　　⑴将雄性SD大鼠随机分组如下进行 MIF时效关系实验：假手术组（Sham）；缺血5 min组（I5min）；缺血15 min组（I15min）；缺血30 min组（I30min）；缺血45 min组（I45min）；缺血60 min组（I60min）；缺血45 min再灌注0.5h组（I45min/R0.5h）；缺血45 min再灌注1h组（I45min/R1h）；缺血45 min再灌注2h组（I45min/R2h）；缺血45 min再灌注3h组（I45min/R3h）；缺血45 min再灌注4h组（I45min/R4h）；缺血45 min再灌注6h组（I45min/R6h）。⑵将雄性SD大鼠随机分组如下进行药效关系实验：假手术组（Sham）；模型组（I45min/R3h）；溶剂组（DMSO）；模型+钙拮抗剂组（F2（1.5 mg/kg）、Ver（0.75 mg/kg）、Nif（0.2 mg/kg）和Dil（0.5 mg/kg））。⑶Western-blot检测心肌组织Cleaved caspase-3的表达。⑷TUNEL检测心肌组织细胞晚期凋亡。⑸ELISA检测心肌组织炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。⑹Western-blot和免疫组织化学法检测心肌组织MIF蛋白的表达。⑺ELISA检测血清MIF的含量。⑻将H9c2心肌细胞随机分组如下进行Cleaved caspase-3时效实验：正常组（Ctrl）；缺氧0.5h组（H0.5h）；缺氧1h组（H1h）；缺氧2h组（H2h）；缺氧3h组（H3h）；缺氧1h复氧0.5h组（H1h/R0.5h）；缺氧1h复氧1h组（H1h/R1h）；缺氧1h复氧2h组（H1h/R2h）；缺氧1h复氧3h组（H1h/R3h）；缺氧1h复氧4h组（H1h/R4h）。⑼将H9c2心肌细胞随机分组如下进行药效实验：正常组（Ctrl）；无钙组（0Ca2+2h）；无钙+钙拮抗剂组（0Ca2+2h+钙拮抗剂）；模型组（H1h/R1h）；溶剂组（DMSO）；模型+钙拮抗剂组（钙拮抗剂）。⑽Western-blot检测Cleaved casepase-3的表达。⑾Annexin V-FITC/PI检测细胞早晚期凋亡。⑿TUNEL检测细胞晚期凋亡。⒀ELISA检测细胞上清液炎症因子IL-6和IL-1β的含量。
　　结果：
　　①与Sham组相比，大鼠心肌缺血45 min再灌注3 h（I45min/R3h）引起心肌Cleaved caspase-3表达增加、凋亡细胞增加、炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量增加。②与I45min/R3h组相比，F2（1.5 mg/kg）能减少大鼠心肌I/R心肌 Cleaved caspase-3表达，减轻细胞凋亡。③与I45min/R3h组相比，F2（1.5 mg/kg）能减少大鼠心肌I/R炎症因子TNF-α表达， F2（1.5 mg/kg）、Ver（0.75 mg/kg）能减少大鼠心肌I/R IL-6的表达，F2（1.5 mg/kg）、Ver（0.75 mg/kg）和Nif（0.2 mg/kg）能减少大鼠心肌I/R IL-1β的表达。④与Sham组相比，大鼠心肌I45min/R3h引起心肌组织MIF蛋白和mRNA表达减少，血清MIF含量增加。与I45min/R3h组相比，F2（1.5 mg/kg）、Ver（0.75 mg/kg）和Nif（0.2 mg/kg）能上调大鼠心肌I/R MIF蛋白表达，F2（1.5 mg/kg）和Nif（0.2 mg/kg）能减少大鼠心肌I/R血清MIF的含量。⑤与Ctrl组相比，H9c2心肌细胞在无钙培养基中培养2 h引起Cleaved caspase-3的表达增加，但是钙拮抗剂不能减少Cleaved caspase-3的表达。与Ctrl组相比，无钙液培养H9c2心肌细胞缺氧1h/复氧1h（H1h/R1h）Cleaved caspase-3增加，Annexin V-FITC/PI检测的早晚期凋亡细胞率增加，TUNEL检测的晚期凋亡细胞率增加，ELISA检测的细胞上清液中IL-6和IL-1β的含量增加。⑥与H1h/R1h组相比，Ver、Nif和F2能显著减少无钙液培养H9c2心肌细胞H/R Cleaved caspase-3的表达，Ver、Nif和F2能剂量依赖地减少无钙液培养 H9c2心肌细胞H/R早晚期凋亡细胞率。⑦与H1h/R1h组相比，Ver、Nif和 F2能剂量依赖地减少无钙液培养 H9c2心肌细胞H/R IL-6和IL-1β的释放。
　　结论：
　　阈下剂量钙拮抗剂Ver、Nif和F2可以拮抗大鼠心肌I/R损伤，并能拮抗无钙液培养H9c2心肌细胞H/R损伤。提示钙拮抗剂可以通过非L-VDCC途径拮抗心肌I/R损伤，其作用机制与调控MIF的异常表达有关。

目录

声明

英文缩略词表

第一章 前言

第二章 阈下剂量钙拮抗剂对大鼠心肌I/R损伤的作用和MIF表达的调控

1 材料和方法

1.1 实验动物

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

1.4 实验器械

1.5 大鼠心肌I/R模型的建立与给药

1. 6 Q-PCR测定大鼠心肌I/R心肌组织MIF mRNA的表达

1.7 心肌组织总蛋白提取和定量

1. 8 Western-blot检测 Cleaved caspase-3和MIF的表达

1.9 TUNEL检心肌组织细胞晚期凋亡

1.10 免疫组化

1.11 ELISA检测炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β

1.12 ELISA测定大鼠血清MIF的含量

2 实验结果

2.1 阈下剂量钙拮抗剂对大鼠心肌I/R Cleaved caspase-3表达的影响

2.2 阈下剂量钙拮抗剂对大鼠心肌I/R心肌晚期细胞凋亡的影响

2.3 阈下剂量钙拮抗剂对大鼠心肌I/R心肌中TNF-α、IL-6和IL-1β含量的影响

2.4 大鼠心肌I/R状态下心肌MIF mRNA、蛋白的表达和血清MIF含量的

2.5 阈下剂量钙拮抗剂对大鼠心肌I/R心肌MIF表达的影响

2.6 阈下剂量拮抗剂对大鼠心肌I/R血清MIF含量的影响

3 小结

第三章钙拮抗剂对无钙液培养H9c2心肌细胞H/R损伤的作用

1 材料与方法

1.1 主要试剂

1.2 主要仪器

1.3 心肌细胞H9c2的复苏与传代

1.4 无钙H/R模型的建立与实验分组

1.5 细胞总蛋白的提取

1.6 Western-blot方法测定Cleaved caspase-3的蛋白的表达

1.7 Annexin V-FITC/PI检测细胞早晚期凋亡

1.8 TUNEL检测细胞晚期凋亡

1.9 ELISA法测定培养上清液中 TNF-α, IL-1β, IL-6浓度

2 实验结果

2.1 无钙液培养H9c2心肌细胞H/R状态下Cleaved caspase-3 表达时效关系

2.2 钙拮抗剂对无钙液培养H9c2心肌细胞H/R Cleaved caspase-3表达的影

2.3 钙拮抗剂对无钙液培养H9c2心肌细胞早晚期凋亡的影响

2.4 TUNEL法检测钙拮抗剂对无钙液培养H9c2心肌细胞H/R细胞晚期凋亡的影响

2.5 钙拮抗剂对无钙液培养H9c2心肌细胞H/R IL-6和IL-1β的影响

3 小结

第四章 讨论

1. 短时间无钙液培养对心肌细胞的影响

2. 钙拮抗剂对无钙液培养H9c2心肌细胞H/R凋亡的作用

3. 大鼠心肌I/R心肌组织MIF mRNA和蛋白的表达与血清MIF含量的关系

4. MIF在大鼠心肌I/R时期的变化和心肌细胞H/R时期变化的差异

5. 实验局限性

第五章 结论与展望

参考文献

论文综述:MIF参与心肌I/R损伤的研究进展

个人简历

致谢