TAG-1调节成年小鼠脑室下区神经干细胞的增殖和神经元分化

摘要

研究背景: 多年来的干细胞研究表明，NSCs的生物特点和自身内源性因素及所处的微环境(niche)密切相关。例如，Bmi-1和TLX是表达于CNS的转录因子。将它们敲除后，可降低成年干细胞的增殖。这些内源性的因子对成年NSCs的维持起特异性的作用；将SVZ细胞移植到另一个SVZ区，明显增加了分化为嗅球(olfactorybulb，OB)神经元的数量。但是，将SVZ细胞移植到非神经发生的脑区，则将严重限制它们神经发生的潜能。将神经前体细胞移植到神经发生区域，它们能够分化为此区域特异性的神经元；将SVZ的前体细胞移植到海马，它们能够分化为海马的神经元；将SGZ的祖细胞移植到向前迁移细胞流(rostralmigrationstream，RMS)，可以产生OB中才具有的酪氨酸羟化酶阳性的中间神经元，说明这种微环境影响了移植神经元的分化类型，将这些神经前体细胞放在体外分化，它们大多数都分化为胶质细胞。出生后的小鼠的SVZ前体细胞在神经轴发育中可以在许多部位分化成神经元，当它们移植到成年脑内时候，大多数分化为胶质细胞。小鼠经过非致死量放射性照射后，经过静脉注射成年小鼠SVZ的前体细胞，它们分化为造血细胞。将来自于成年小鼠SVZ的干细胞做上标记，然后移植到4周龄的鸡胚或者发育中的小鼠桑椹胚或者囊胚，它们能够整合到心脏、肝脏和小肠，并且表达这些器官特异性的蛋白。大量的细胞替代疗法的试验研究显示，移植后细胞不存活，少量存活，但是无法恢复正常功能，这些都说明，SVZ和SGZ的干细胞受其所处的微环境调节，除了调节干细胞的数量，同时还决定着神经元发生、存活。微环境指的是干细胞生活的特殊微环境，由其中的细胞、可溶性因子、限制性膜分子、血管和细胞外基质等成分构成，调节干细胞生理条件下的功能，能够使得干细胞自我更新、增殖或者分化，参与组织的再生、维持和修复。因此，对干细胞自身内源性因素和所处的微环境的了解，它们在干细胞增殖、分化中的作用、病理变化下的改变及对干细胞行为的影响是对NSCs生物行为理解的关键，也是将来细胞替代疗法应用的关键。 TAG-1是一种神经细胞粘附分子，属于免疫球蛋白超家族的一员，主要在发育中的、成年的CNS中以一种动态的复杂的形式表达，在轴突的生长、定向及形成高度顺序性的神经连接方面起着重要的作用。APP是一种I型跨膜蛋白，类似于notch受体，包括长的胞外段和短的胞内段，它们主要表达与脑和其它组织，并且也存在于脊椎动物、果蝇和新杆状线虫。经过三种内分泌酶α、β、γ对APP不同的部位进行剪切，产生Aβ。后者是被认为是产生AD的主要因素。 本研究小组在近期首次发现，TAG-1作为APP的功能性的配基，在胚胎发育中触发淀粉样蛋白细胞内结构域(APPintracellulardomain，AICD)的转录活化，并抑制胚胎NSCs的神经元发生。模式图如下。 本试验探讨成年小鼠最大的NSCs区一脑室下区NSCs的微环境分子TAG-1对其增殖、凋亡、神经元分化的影响，理解其对小鼠NSCs增殖、分化的影响。成年体内TAG-1/APP信号途径对NSCs的神经元分化还不得而知。若是抑制神经元的发生，则可以进行NSCs的siRNA干扰，沉默此信号途径，促进NSCs向神经元分化，恢复受损的神经元；若此信号途径促进NSCs的神经元分化，可以将NSCs在体外进行基因修饰，过度表达TAG-1/APP，进一步促进NSCs向神经元分化，恢复神经功能而起治疗作用。本实验探索成年小鼠脑室下区NSCs分子TAG-1、APP对其生物性特性的影响，既为将来NSCs的替代疗法奠定基础，也为AD发病机制、可能的干细胞治疗提供实验依据。目前为止，尚未见该方面的研究报道。 第一部分：TAG-1维持成年小鼠脑室下区神经干细胞的增殖 目的：探讨TAG-1分子对成年小鼠脑室下区神经干细胞的增殖的影响 方法：用免疫组织化学和细胞化学的方法确定TAG-1在成年小鼠SVZ神经干细胞上表达，用Westernblot实验进一步证实。利用TAG-1基因敲除小鼠和它们的同窝仔对照进行体内外实验。体内实验，用BrdU标记的方法，探讨TAG-1对成年小鼠SVZ神经干细胞增殖的影响，Tunel染色观察这些神经干细胞凋亡的变化；体外实验，用SVZ神经干细胞培养、培养的神经干细胞BrdU标记观察细胞增殖、流式细胞仪检测神经干细胞细胞周期及凋亡情况，观察TAG-1基因敲除后对SVZ来源的神经干细胞增殖、凋亡的影响。 结果：成年小时脑室下区存在神经干细胞，它们表达神经干细胞分子标记nestin和SOX2。这些神经干细胞都表达TAG-1分子，Westernblot实验也证实了这点。体内实验发现，和正常小鼠相比较，TAG-1基因敲除的小鼠，SVZ神经干细胞增殖下降有显著性意义(t=8.251，P=0.014)，而凋亡变化无显著性意义(t=2.000，P=1.84)。体外实验发现，TAG-1基因敲除小鼠SVZ来源的神经干细胞数量减少有显著性意义(t=4.3437，P=0.0491)，同样的细胞密度培养，TAG-1基因敲除后形成了更少的神经球，差异有显著性(t=12.4384，P=0.0064)；BrdU整合实验发现TAG-1基因敲除后处于分裂的神经干细胞减少有显著性意义(t=5.4240，P=0.0324)，而凋亡变化无显著性意义(t=1.8708，P=0.1347)；流式细胞仪检测发现TAG-1基因敲除后SVZ来源的神经干细胞分裂期缩短有显著性意义(t=4.610，P=0.0440)，静止期的比例增加也有显著性意义(t=-5.817，P=0.028)，凋亡没有变化。 结论：TAG-1表达与成年小鼠脑室下区神经干细胞；TAG-1基因敲除后小鼠脑室下区神经干细胞增殖明显减少而凋亡没有变化；TAG-1维持了成年小鼠脑室下区神经干细胞的增殖，可能通过TAG-1/APP信号途径发挥作用。 第二部分：TAG-1调节成年小鼠脑室下区神经干细胞的神经元分化 目的：探讨TAG-1对成年小鼠脑室下区神经干细胞的神经元分化的调节及可能的调节机制。 方法：利用TAG-1、APP、TAG-1/APP双重基因敲除、Fe65基因敲除小鼠和它们的同窝仔对照进行实验。高剂量腹腔注射BrdU(100mg/Kg)，每天注射3次，连续注射2天，1个月后杀死小鼠取脑制作切片，观察嗅球新增加是神经元的变化情况。 结果：分别和它们的对照组相比较，TAG-1、APP基因敲除组、TAG-1/APP双重基因敲除组，嗅球神经元分化增加均有显著性意义(它们分别为t=-4.798，P=0.0408；t=15.454，P=0.0042；F=0.327，t=-3.696，P=0.0209)，而Fe65基因敲除后嗅球神经元分化变化无显著性意义(t=-0.25，P=0.8261)。 结论：TAG-1阴性调节了脑室下区神经干细胞的神经元分化，是通过TAG-1/APP信号途径完成的，Fe65对此过程无明显影响。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词对照表

声明

前言

第一部分TAG-1维持成年小鼠脑室下区神经干细胞的增殖

1.1材料

1.2方法

1.3结果

1.4讨论

1.5小结

1.5参考文献

第一部分附图

第二部分 TAG-1负性调节成年小鼠脑室下区神经干细胞的神经元分化

2.1材料

2.2方法

2.3结果

2.4讨论

2.5小结

2.6参考文献

第二部分附图

全文总结

综述一 脑室下区神经干细胞的微环境

综述二 成年体脑室下区神经元的发生

学习期间撰写的文章

致谢

研究生毕业论文统计学审稿证明