早期干预糖基化终产物生成对糖尿病大鼠肾内肾素-血管紧张素系统抑制作用的初步研究

摘要

本课题采用链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）诱导的1型糖尿病（Type 1 diabetes mellitus，T1DM）大鼠模型作为观察对象，利用氨基胍（Aminoguanidine，AG）干预AGEs生成，通过观察早期抑制AGEs生成对糖尿病大鼠肾脏形态、功能的保护作用，及对肾脏ACE2，ACE及AngⅡ等iRAS关键成分的影响，探讨早期抑制AGEs生成阻断iRAS激活的可能机制，从而为DN的防治提供新的治疗策略。具体研究分为以下两个部分： 第一章、早期干预AGEs生成对糖尿病大鼠肾脏形态及功能的保护作用。 目的： 通过观察早期应用氨基胍对STZ诱导的TIDM大鼠肾脏形态及功能的影响，探讨早期抑制AGEs生成对糖尿病肾病发病的干预作用。 方法： 1、采用8周龄雄性Wistar大鼠为实验对象，随机分3组：（1）Ctrl组：正常对照组（n=7）；（2）DM组：糖尿病无干预组（n=14）；（3）DMA组：糖尿病氨基胍干预组（n=14）。各组大鼠隔夜禁食12～16h后，予DM组和DMA组一次性腹腔注射STZ （55mg/Kg体重），Ctrl组注射等体积的0.1M柠檬酸缓冲液，72小时后尾静脉采血，用快速血糖仪测定全血血糖，血糖≥16.7mmol/L为糖尿病造模成功。糖尿病制模成功后立即予DMA组氨基胍（AG，溶于饮水中，浓度为1g/L）每日饮用。为避免发生酮症酸中毒和提高模型存活率，在造模4周内对血糖超过30mmol/L的大鼠给予皮下注射长效胰岛素（来得时）2～4U/隔日。 2、每4周检测各组大鼠血糖，体重变化。给药12周后，用代谢笼收集各组大鼠24h尿液，使用ELISA试剂盒检测尿白蛋白含量。取血、尿标本，检测血肌酐浓度（Scr）以及尿肌酐浓度（Ucr），并计算内生肌酐清除率（Ccr），结果用12周末的体重校正。以尿白蛋白排泄率（UAER）及Ccr作为评价肾功能的指标。 3、肾组织的处理及病理改变评价指标：STZ注射后第12周末，大鼠麻醉后，在腹主动脉末端插入导管，取血注入促凝管中待测血肌酐，后用PBS以适当速度进行原位肾脏灌洗以清除肾内血液，取下双肾，迅速剥去肾包膜，称重后纵向剖开肾脏，切取0.5×0.5×0.2cm大小肾脏组织置于10%中性福尔马林缓冲液中固定20h。常规脱水、透明、石蜡包埋，切片厚度2um，过碘酸席夫氏染色（PAS）染色，光镜下观察肾组织形态学变化。肾脏病理评价指标如下：（1）肾脏质量指数（RMI）：RMI=双肾平均重量/体重；（2）肾小球肥大：运用Image-Pro Plus 5.1彩色图像分析系统，测量肾小球横截面面积（Ag），肾小球体积（Vg）=1.25×（Ag）3/2。（3）系膜基质扩张程度：半定量评分（1～4分）1分-正常或最小；2分-轻度；3分-中度； 4分-弥漫性。（4）肾小管病变程度：半定量评分（1～4分）1分：病变1～25%；2分：病变26～50%；3分：病变51～75%；4分：病变>75。 4、统计方法：所有数据由SPSS 13.0统计软件处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，符合正态分布和方差齐性时用单因素方差分析（ONE-WAYANOVA），进一步组间多重比较采用Bonferroni法。不满足方差齐性用Welch法对F值进行校正，进一步多重比较用Dunnett T3法。P<0.05为差异有统计学意义。不符合正态分布时用Kruskal-Wallis H法，两组间比较用Mann-Whitney U法，P<校正后的α为差异有统计学意义。 结果： 1、各组大鼠在造模前体重无显著差异（P=0.968）。STZ造成糖尿病模型成功后，糖尿病大鼠血糖显著高于Ctrl组大鼠血糖（P<0.01），氨基胍进行干预前，DM组与DMA组大鼠血糖无显著差异（P=0.684）。DM组大鼠血糖随着时间呈进行性升高，并且体重明显低于正常组（P<0.01）， 50%的DM大鼠于10周左右出现单或双眼白内障。DMA组大鼠4、8周末血糖水平与DM组无明显差异（P>0.05），第12周末血糖较DM组减少（P<0.05），与DM组大鼠相比，DMA组大鼠体重改善不明显（P>0.05），23%的DMA大鼠于10周左右出现单或双眼白内障。 2、肾脏功能：DM组大鼠24小时UAER及Ccr均显著高于Ctrl组（P<0.01），DMA组大鼠UAER显著低于DM组大鼠（P<0.001），Ccr虽然较DM组有所下降，但无统计学差异（P>0.05）。 3、肾脏病理改变：光镜下，12周末DM组大鼠肾组织可见肾小球的毛细血管球肥大，系膜基质轻度增生，肾小管上皮细胞肥大。与Ctrl组大鼠相比，DM组大鼠肾脏质量指数，肾小球横截面面积和体积，肾小球系膜基质扩张，肾小管病变程度均显著增加（P<0.05），DMA组大鼠肾脏质量指数，肾小球横截面面积，肾小球体积，及肾小球系膜基质扩张，肾小管病变程度均较DM组显著减少（P<0.05）。 结论： 1、STZ诱导的TIDM大鼠在第12周末已发展为早期肾病，表现为肾小球肥大，系膜基质增生和肾小管病变等，并出现明显的白蛋白尿，肌酐清除率增加； 2、早期抑制AGEs能够保护肾脏正常形态结构，并且显著降低尿白蛋白，延缓了DN进展。 第二章、早期干预AGEs生成对糖尿病大鼠iRAS抑制作用的初步研究。 目的： 通过氨基胍早期干预，观察早期抑制AGEs生成对T1DM大鼠肾内肾素-血管紧张素系统（iRAS）关键成分的影响，探讨干预AGEs生成对iRAS抑制作用的可能机制。 方法： 1、实验动物、分组和干预措施同第一部分。 2、取第一部分中已处理的各组大鼠的肾脏组织蜡块，以石蜡切片机连续切片，厚度5um。用免疫组化法标记ACE2，ACE及Ang Ⅱ阳性细胞，观察ACE2，ACE及Ang Ⅱ在各组大鼠肾脏中的分布，运用Image-Pro Plus 5.1彩色图像分析系统检测的平均光密度值表示上述指标表达情况。 3、肾组织总RNA的提取用Trizol提取法，半定量反转录PCR检测肾组织ACE2mRNA表达情况，凝胶图像分析系统观察结果，检测各组ACE2mRNA条带的灰度值，并计算ACE2mRNA条带与内参β-actin条带的灰度比值，观察ACE2mRNA表达情况。 4、统计分析：所有数据由SPSS 13.0统计软件处理，计量资料以均数±标准差（x±s表示，符合正态分布和方差齐性时用单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA），进一步组间多重比较采用Bonferroni法。不满足方差齐性用Welch法对F值进行校正，进一步多重比较用Dunnett T3法。P<0.05为差异有统计学意义。 结果： 1、氨基胍对糖尿病大鼠AGEs表达的影响：12周末，正常大鼠肾小管及肾小球见少量AGEs表达。DM组大鼠肾小管中AGEs表达明显增多，肾小球及间质中也见表达。DMA组大鼠肾小管及肾小球中AGEs表达减少。 2、氨基胍对糖尿病大鼠ACE2表达的影响：与正常大鼠相比，DM组大鼠肾小管及肾小球中ACE2免疫组化阳性染色显著降低（P均<0.01）。DMA组较DM组大鼠肾小管及肾小球中ACE2阳性染色显著增加（P均<0.01）。 3、氨基胍对糖尿病大鼠ACE表达的影响：与正常大鼠相比，DM组大鼠肾小球、肾小管、肾小动脉内皮ACE免疫组化阳性染色均显著增加（P均<0.01）。DMA组肾小球、肾小管、肾小动脉内皮ACE阳性染色显著减少（P均<0.01）。 4、氨基胍对糖尿病大鼠AngⅡ表达的影响：与正常大鼠相比，DM组大鼠肾小管及肾小球中AngⅡ免疫组化阳性染色显著增加（P均<0.01）。DMA组较DM组大鼠肾小管及肾小球中AngⅡ阳性染色显著降低（P均<0.01）。 5、氨基胍对糖尿病大鼠ACE2mRNA表达的影响：与正常大鼠相比，DM组大鼠肾脏ACE2mRNA表达显著减少（P<0.01）。DMA组较DM组大鼠肾脏ACE2mRNA表达显著增加（P<0.01）。 结论： 1、第12周末糖尿病大鼠AGEs在肾内大量蓄积，同时iRAS激活，主要表现为肾内ACE2表达减少，ACE、AngⅡ表达明显增多，加速DN进展； 2、早期干预AGEs生成能显著延缓DN发生，机制可能与早期抑制iRAS激活，增加肾内ACE2表达，减少ACE、AngⅡ表达有密切关系。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

第一章 早期干预AGEs生成对糖尿病大鼠肾脏形态及功能的保护作用

第1节实验材料

第2节实验方法

第3节结果

第4节讨论

第5节结论

第二章 早期干预AGEs生成对糖尿病大鼠iRAS抑制作用的初步研究

第1节实验材料

第2节实验方法

第3节结果

第4节讨论

第5节结论

参考文献

综述：血管紧张素转化酶相关羧肽酶——预防糖尿病肾病潜在的新靶点

攻读学位期间发表论文情况

致 谢