苯妥英钠停药对氨基酸递质及相关代谢酶和转运体的影响

摘要

目的：近年来星形胶质细胞在中枢神经系统中的作用正日益受到重视,而且星形胶质细胞与癫痫的发生与发展有着密切的关系。本课题旨在通过研究苯妥英钠(Phenytoin Sodium)慢性作用及停药后对人星状胶质细胞(humanastrocytes,HA)氨基酸递质的释放以及与之密切相关的多种代谢酶及转运体mRNA表达的影响,探讨星形胶质细胞在苯妥英钠抗癫痫机制以及停药反跳机制中所起的作用,以期为更好地预防和控制苯妥英钠停药反跳以及新型抗癫痫药物的研究与开发提供实验依据。
　　 方法：本实验用人星状胶质细胞建立苯妥英钠慢性作用的星形胶质细胞模型。从氨基酸递质释放、mRNA表达和蛋白表达三个水平以及停药后0小时、12小时、24小时、36小时、48小时和60小时六个时间点来检测苯妥英钠慢性作用后快速停药对HA细胞的影响。本实验采用高效液相色谱(High performanceliquid chromatography,HPLC)检测HA细胞天门冬氨酸(Aspartate,Asp)、谷氨酸(Glutamatc,Glu)、天门冬酰胺(Asparatmine,Asn)、谷氨酰胺(Glutamine,Gln)、甘氨酸(Glycine,Gly)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的释放量；采用实时荧光定量PCR方法检测与这些氨基酸代谢相关的酶及其转运体mRNA表达水平的变化,包括谷氨酸脱氢酶(GLUD1)、谷草转氨酶1(GOT1)、谷草转氨酶2(GOT2)、谷丙转氨酶(GPT)、谷氨酰胺合成酶(GLUL)、丙酮酸羧化酶(PC)、谷氨酰胺酶(GLS)、天门冬酰胺酶(ASRGL1)、高亲和力天门冬氨酸/谷氨酸转运体(SLC1A6)、神经递质转运体(SLC6A12)、中性氨基酸转运体(SLC6A15、SLC6A19)、谷氨酸脱羧酶1(GAD-1)、谷氨酸脱羧酶2(GAD-2)、甘氨酸裂解体系蛋白(GCSH)、GABA转氨酶(ABAT)、谷氨酸转运体1(GLT-1/EAAT-2)、谷氨酸/天门冬氨酸转运体(GLAST)、GABA转运体3(GAT-3)；用western blot方法检测谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GLUL)蛋白表达水平的变化。
　　 结果：1、苯妥英钠慢性作用可促进HA细胞Gly和GABA的释放,抑制Glu的释放,而对Gln,Asn和Asp的释放的影响没有统计学意义。停药后Glu、Gly和GABA的释放呈反跳样变化。
　　 2、实时荧光定量PCR检测结果显示,苯妥英钠慢性作用使谷氨酸脱羧酶1(GAD-1)、谷氨酸脱羧酶2(GAD-2)、谷氨酸转运体l(GLT-1/EAAT-2)、谷氨酸/天门冬氨酸转运体(GLAST)mRNA相对表达量升高,使甘氨酸裂解体系蛋白(GCSH)、GABA转氨酶(ABAT)、GABA转运体3(GAT-3)的mRNA相对表达量降低,停药后这些基因的mRNA相对表达量呈反跳样变化。谷氨酸脱氢酶(GLUD1)、谷草转氨酶1(GOT1)、谷草转氨酶2(GOT2)、谷丙转氨酶(GPT)、谷氨酰胺合成酶(GLUL)、丙酮酸羧化酶(PC)、谷氨酰胺酶(GLS)、天门冬酰胺酶(ASRGL1)、高亲和力天门冬氨酸/谷氨酸转运体(SLC1A6)、神经递质转运体(SLC6A12)、中性氨基酸转运体(SLC6A15、SLC6A19)的mRNA相对表达量在给药和给药停药后没有发生显著性变化。
　　 苯妥英钠慢性给药后及给药停药后,对HA细胞的GLUL蛋白的变化没有可检测到的影响,这与之前的氨基酸检测、氨基酸代谢酶及相关转运体的检测结果相吻合。
　　 结论：采用HPLC检测HA细胞在苯妥英钠慢性作用及停药后Asp、Glu、Asn、Gln、Gly和GABA释放量的变化。结果显示,苯妥英钠慢性作用可促进HA细胞Gly和GABA的释放,抑制Glu的释放,而对Asn、Asp和Gln的释放的影响没有显著性意义。提示苯妥英钠慢性作用后停药可引起HA细胞Glu、Asp和GABA的释放呈反跳样变化,对Asn、Asp和Gln的释放的影响也没有显著性意义。实时荧光定量PCR检测结果显示,苯妥英钠慢性作用使与之相关的一些代谢酶及转运体如谷氨酸脱羧酶1(GAD-1)、谷氨酸脱羧酶2(GAD-2)、谷氨酸转运体1(GLT-1/EAAT-2)、谷氨酸/天门冬氨酸转运体(GLAST)mRNA相对表达量升高,甘氨酸裂解体系蛋白(GCSH)、GABA转氨酶(ABAT)、GABA转运体3(GAT-3)的mRNA相对表达量降低,停药后这些基因的mRNA相对表达量呈反跳样变化。提示这种变化与苯妥英钠停药反跳的发生可能有关。谷氨酸脱氢酶(GLUD1)、谷草转氨酶1(GOT1)、谷草转氨酶2(GOT2)、谷丙转氨酶(GPT)、谷氨酰胺合成酶(GLUL)、丙酮酸羧化酶(PC)、谷氨酰胺酶(GLS)、天门冬酰胺酶(ASRGL1)、高亲和力天门冬氨酸/谷氨酸转运体(SLC1A6)、神经递质转运体(SLC6A12)、中性氨基酸转运体(SLC6A15、SLC6A19)的mRNA相对表达量在给药和给药停药后没有发生显著性变化。提示这种变化与苯妥英钠停药反跳的发生可能没有关系。
　　 Western blot结果显示,苯妥英钠慢性作用对HA细胞的GLUL蛋白表达没有可检测到的变化。给药后GLUL蛋白表达与给药组、对照组,也没有可检测到的差异,说明GLUL蛋白可能与苯妥英钠停药反跳发生的机制无关。
　　 可见,苯妥英钠慢性作用后停药可引起HA细胞Glu、Asp和GABA的释放呈反跳样变化,与之相关的一些代谢酶及转运体mRNA表达水平也出现相应的反跳样变化,提示这种变化与苯妥英钠停药反跳的发生有关。由此推测星形胶质细胞的氨基酸释放能力在苯妥英钠抗癫痫机制中具有重要作用,与苯妥英钠停药反跳的发生密切相关。详细机制尚需进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言

第二章 材料与方法

第三章 结果

1 标准曲线

2 苯妥英钠慢性作用和苯妥英钠慢性作用后停药对氨基酸递质释放的影响29

3 苯妥英钠慢性作用及停药对几种氨基酸递质代谢相关酶和相关膜转运体的MRNA表达的影响

第四章 讨论

第五章 结论

第六章 参考文献

英文缩略词表(ABBREVIATIONS)

致谢.

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