DHPLC检测多种途径获取的NSCLC组织EGFR基因突变及NSCLC原发病灶与配对淋巴结转移灶中EGFR/K-ras基因型的比较

摘要

肺癌是目前全球死亡率最高的恶性肿瘤,因为缺乏特异性症状及有效的筛查手段,仅16％患者初诊时为早期,其中大多数为非小细胞肺癌(non-small celllung cancer,NSCLC)。目前 NSCLC的治疗效果难以令人满意,现主要的治疗手段包括手术、放疗、化疗、靶向治疗等,而手术是唯一的根治手段。患者表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶区(tyrosinekinase,TK)已成为目前研究进展最快,最受瞩目的NSCLC 治疗靶点,吉非替尼、厄罗替尼作为常见的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs),已广泛应用于治疗 NSCLC 晚期病人。TKIs的疗效与 EGFR TK 区是否存在突变以及突变类型有关。K-ras 是 RAS 家族的重要成员,K-ras 突变与 EGFR TKIs的原发耐药相关,同时 K-ras 突变与 NSCLC 患者预后不良密切相关。据此,在对晚期 NSCLC 患者进行治疗决策前,明确其 EGFR/K-ras基因型是非常必要的。目前,DNA直接测序是检测 EGFR 突变最常用的方法,同时也作为突变检测的“金标准”,但该方法步骤繁琐、耗时较长、费用较高、所需组织量较多且敏感度较低,并不能满足临床需求。变性高效液相色谱(denaturing high performanceliquid chromatography,DHPLC)是一种新的高通量筛选基因序列变异的技术,其原理是利用离子对反向高效液相色谱法在部分变性的温度条件下分离、识别野生型及突变型 DNA 双链,具有快速、自动化、敏感性、特异性高等特点,可用于基因突变的检测。TKIs 已在晚期 EGFR 敏感性突变的NSCLC 患者的治疗中获得巨大的成功,应用 TKIs 进行可手术患者的诱导治疗已成为新的探索模式。恶性肿瘤是异质性明显的疾病,众多研究发现同一 NSCLC 患者的原发病灶及转移灶之间。EGFR/K-ras 基因状态也存在较大的差异。本研究尝试探讨DHPLC 快速检测由多种途径获取的NSCLC 肿瘤组织 EGFR 基因突变的诊断价值,此外比较了非小细胞肺癌原发灶与配对淋巴结转移灶中 EGFR/K-ras 基因型的相关性。
　　 本研究分为两部分。
　　 第一部分:DHPLC检测多种途径获取的NSCLC 组织EGFR 基因突变
　　 目的:探讨DHPLC快速检测由 CT 引导经皮细针肺穿刺活检、淋巴结活检以及外科切除三种途径获取的NSCLC 肿瘤组织 EGFR 基因突变的诊断价值,并分析 EGFR 突变与患者临床特征之间的相关性。
　　 方法:
　　 1.选取2008年1月至2009年6月广东省人民医院收治的83位非小细胞肺癌患者的肿瘤组织,其中CT引导经皮细针肺穿刺活检标本37份、淋巴结活检标本15份、以及外科切除标本31份。所有肿瘤标本离体后等分为二,一部分以10％中性福尔马林固定用于石蜡切片、病理论断,另一部分立即置入液氮中,后转入-80℃低温冰箱中保存备用。所有患者获取标本前均未接受化疗或靶向治疗,相应组织经病理确诊后纳入研究。
　　 2.组织DNA的提取:组织匀浆法提取肿瘤组织中的总DNA,经Eppendorf核酸蛋白测定仪测定DNA纯度及含量。
　　 3.采用TA克隆法分别构建EGFR基因19外显子、21外显子突变型(de1746-750、L858R)和野生型质粒,分别按1:1、1:5、1:10、1:20、1:50、1:100比例将突变型、野生型混合,用于直接测序法、DHPLC 法检测敏感性分析。
　　 4.PCR扩增EGFR基因19、21外显子的基因片段,2％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增片段。PCR产物分别用作直接测序法及DHPLC法检测。
　　 5.PCR 产物切胶过柱纯化后使用 ABI3100 测序仪进行测序检测,采用Chromas 软件分析测序图谱。
　　 6.PCR 产物不作任何纯化处理,直接用于 DHPLC 分析。检测敏感性分析中EGFR19 外显子分别采用非变性条件及部分变性条件进行检测,并进行比较；21 外显子采用部分变性条件进行检测。对肿瘤组织EGFR19 外显子、21 外显子均采用部分变性条件进行检测。
　　 7.统计学分析:采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。应用x2检验比较EGFR突变与患者性别、吸烟状态、病理类型的关系。应用两独立样本t检验比较EGFR突变型与野生型患者之间年龄是否存在差异。以 P<0.05 认为差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 1.DHPLC 检测的敏感性:当突变型质粒与野生型质粒按 1:100 混合时,仍可被 DHPLC 法显著检出,而直接测序法仅可检出 1:10 水平。非变性条件及部分变性条件检测 EGFR 19 外显子敏感性相似。
　　 2.83 例 NSCLC 组织标本中,DHPLC 法检出 22 例 EGFR 突变(突变率26.51％),3 例直接测序法结果为野生型,余19例 EGFR 突变及 61 例野生型均与直接测序法结果相符。以直接测序法为参考标准,DHPLC 法的敏感度为100％,特异度为95.31％,检测对经皮细针肺穿刺活检、淋巴结活检以及外科切除等途径获取的肿瘤样本的敏感度均为100％,特异度分别为96.55％、100.00％及 92.00％。
　　 3.以 DHPLC 法为参考标准,直接测序法的敏感度为86.36％。
　　 4.女性患者 EGFR 突变率(37.93％)高于男性患者(突变率14.81％,x2=5.712,P=0.017),腺癌患者 EGFR 突变率(32.14％)高于非腺癌患者(突变率 3.70％,x2=8.347,P=0.004),差异均有统计学意义；符合女性、非吸烟、腺癌的NSCLC 患者 EGFR 突变率达40.74％。但EGFR 突变与患者吸烟状态无显著相关(P>0.05)。
　　 结论:
　　 本研究发现,DHPLC 法具有很高的检测敏感性,部分变性条件也适用于EGFR 19 外显子检测,而且有利于发现未知突变。DHPLC 作为 EGFR 突变检测的初筛方法,与“金标准”具有高度的一致性。同时本研究中肿瘤样本分别来源于经皮肺穿刺、淋巴结活检以及外科手术切除三种临床最常用的途径,DHPLC 均获得与直接测序法高度一致的结果,显示该方法对不同类型的标本均可有效地进行突变检测。同时本研究结果提示83例NSCLC患者EGFR突变率为 22.89％,女性、腺癌患者中EGFR突变率显著高于男性、非腺癌患者,EGFR突变与吸烟状态、年龄等临床特征无显著相关。综上所述,DHPLC 法可作为NSCLC 患者 EGFR 基因型的初筛方法。
　　 第二部分:非小细胞肺癌原发灶与配对淋巴结转移灶中EGFR/K-ras 基因型的比较
　　 目的:探讨非小细胞肺癌原发灶与配对淋巴结转移灶之间 EGFR/K-ras 基因型的相关性。
　　 方法
　　 1.选取2007年5月至2010年2月广东省人民医院收治的21位非小细胞肺癌患者的原发病灶及淋巴结转移灶肿瘤组织。其中原发病灶取自手术切除者14例,取自CT引导下经皮肺穿刺者7例；淋巴结病灶取自手术切除者7例,取自纵隔镜活检者11例,取自锁骨下淋巴结活检术者3例。所有肿瘤标本离体后均分为二,一部分使用10％中性福尔马林固定送广东省人民医院病理科行常规病理论断；一部分立即投入液氮中冻存,后转入-80°超低温冰箱中备用。
　　 2.组织DNA的提取:组织匀浆法提取肿瘤组织中的总DNA,经Eppendorf核酸蛋白测定仪测定DNA纯度及含量。
　　 3.PCR扩增EGFR基因18-21外显子和K-ras12、13密码子以及59密码子的基因片段,2％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增片段。PCR产物用作直接测序。
　　 4.PCR 产物切胶过柱纯化后使用 ABI3100 测序仪进行测序检测,采用Chromas 软件分析测序图谱,突变 DNA 阳性结果再通过反向引物测序进行验证。
　　 5.统计学分析:采用 SPSS 13.0 软件进行统计学分析。应用 Kappa 一致性检验比较 NSCLC 原发病灶及配对的淋巴结转移灶之间 EGFR/K-ras 基因型的一致性,以P<0.05 认为一致性有统计学意义,并参考 Kappa 系数评价标准,当 Kappa系数<0,认为一致性强度极差；0.0-0.2,微弱；0.21-0.40,弱；0.41-0.60,中度；0.61-0.80,高度；0.81-1.00,极强。
　　 结论:采用新鲜肿瘤组织进行检测,无论是同时或异时获取,同一患者配对的NSCLC原发病灶和区域淋巴结转移灶间EGFR/K-ras基因状态基本一致。但有待扩大样本量进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

第一部分 :DHPLC检测多种途径获取的NSCLC组织的EGFR基因突变

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分 :非小细胞肺癌原发灶与配对淋巴结转移灶中EGFR/K-ras基因型的比较

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第三部分 :全文结论

参考文献

主要英文缩略词表

致谢

统计学证明