人原发性脑干损伤后脑干NOS和HIF-1的表达变化

摘要

原发性脑干损伤(primary brain stem injury,PBSI)通常是指暴力作用于头部引起脑干为主的脑损伤,包括原发性脑干轴索损伤、挫裂伤和出血等,伤后可立即导致死亡或持续时间较长的昏迷,是颅脑损伤最重要的损伤和最易于引起死亡的因为之一。由于脑干损伤后死亡率较高、死亡者伤后存活时间短,常规病理学难以观察到有形态学变化,但可能会在分子水平有显著性改变,为此需要从分子水平研究脑干损伤。因此,寻找稳定、可靠的分子指标及检测方法对PBSI的诊断以明确死亡因为成为法医病理学一个亟需解决的问题。
　　 有研究表明,一氧化氮(NO)在脑缺血性脑组织损害中发挥着重要作用,一氧化氮合酶(NOS)是NO合成过程中必需的酶,催化左旋L-精氨酸合成内源性的NO。NOS有三种亚型:内皮细胞型 NOS(eNOS),主要存在于血管内皮细胞；神经元型NOS(nNOS),主要分布于神经细胞；诱导型 NOS(iNOS),主要存在于巨噬细胞；其中 eNOS和 nNOS又合称结构型 NOS(cNOS)。应用非特异性的NOS受体阻断剂左硝基精氨酸甲酯阻断颈动脉结扎大鼠,结果既可能缩小脑缺血灶的梗死区也可能加重脑缺血的损伤,提示NOS的三种亚型对组织具有不同的效应。目前已知在哺乳动物细胞中广泛存在一个O2敏感的基因表达调控系统,调节缺氧状况下涉及的一系列特定基因的表达缺氧诱导因子1(hypoxia-induciblefactor1,HIF1)作为缺氧应答的全局性调控因子能够广泛激活缺氧相关生理反应的众多基因如VEGF等,精确调节细胞代谢中的氧气浓度。脑干损伤必然会导致供氧降低,脑干缺氧后会刺激侧枝循环形成以代偿组织的需要。缺血缺氧能引起HIF1基因表达上调。目前对HIF在脑干损伤中的表达变化规律研究较少,而将它应用于法医死因鉴定更鲜有报道。
　　 目的：
　　 观察原发性脑干损伤死亡者脑干内NOS、HIF的表达变化,为原发性脑干损伤致死的病理学诊断、法医学死因推断提供稳定、简便、可行的检测指标及方法。
　　 方法与结果：
　　 1.研究对象
　　 人体脑干检材为广州市刑事科学技术研究所2006年-2009年收集的尸体解剖检案,从中筛选出死亡后48小时内解剖的、符合实验要求的脑干标本30例,男27例,女3例,年龄3—75岁。伤后存活时间:5分钟-72小时。对照组选取5例非颅脑损伤所致急性死亡案例。按伤后存活时间长短,将脑干损伤组分为6组:1h内组、1-6h组、6-12h组、12-24h组、24-48h组、48-72h组,每组5例。
　　 2.实验方法与结果
　　 2.1 HE染色采用水平面切法,循脑干易损的双侧颅神经根部及重要神经核团为准,前自脑干腹侧,后至脑干背侧止,作4块水平面切块。标本 HE染色光镜下观察,见有:脑干周边浅表部和脑干内部出血,部分出血灶周围见神经细胞肿胀、或细胞浆嗜酸性增强,细胞质内尼氏体减少甚至消失、细胞核皱缩,核质聚集深染；颅神经的根部及其周围脑组织出血；胶质细胞反应性增生,胞浆嗜酸性增强；存活时间较长者可见局灶性软化灶形成、神经纤维肿胀、排列紊乱。
　　 2.2比色法检测脑干神经元内总 NOS、iNOS、cNOS活性
　　 选取对照组、1h内组、48—72h组为实验对象,每组5例。严格按照NOS测定试剂盒(分型)的操作步骤进行。
　　 结果发现:与对照组相比,1h死亡组脑干的NOS和cNOS均升高,iNOS无显著性变化；48-72h组NOS和 iNOS升高,cNOS无显著性差异。(cNOS=NOS-iNOS)
　　 2.3免疫组化检测脑干神经元 nNOS和 HIF的改变
　　 2.3.1 nNOS
　　 正常对照组脑干仅见少量nNOS阳性神经细胞,1h死亡组可见大量阳性细胞分布,与对照组比较有显著性差异,且随时间增加阳性神经细胞数增多,表达强度增强；24h到达高峰,随后表达减弱。
　　 2.3.2 HIF—1α
　　 对照组神经细胞偶见 HIF-1α表达,伤后1h死亡组可见表达 HIF—1α的神经细胞数增多,表达强度增强,差异有统计学意义；随着时间的增加,HIF—1α阳性表达的神经细胞增多,48 h达高峰。
　　 结论：
　　 NOS、HIF-1α参与了原发性脑干损伤的过程,脑干损伤后NOS、HIF—1α蛋白随损伤时间变化的规律为原发性脑干损伤的法医学鉴定提供了新的方法,通过更加系统和进一步的研究可望应用于法医学实践。