Avastin对兔眼小梁切除术后滤过泡血管内皮生长因子(VEGF)和转化生长因子(TGF-β2)抑制作用的实验研究

摘要

青光眼小梁切除术是目前临床最常用的抗青光眼手术方式，滤过泡瘢痕化则导致手术造成的新房水通道受阻，眼压升高，是小梁切除术失败的主要原因。随着分子生物学等相关科学技术的发展，对瘢痕形成过程中细胞因子的研究越来越深入，从分子水平来研究、寻找高效低毒的抗纤维化药物，可能是提高青光眼滤过手术成功率的有效途径。
　　 手术造成的组织创伤引发含新生血管、成纤维细胞及纤维组织的肉芽组织修复，其中新生血管生成是修复过程中重要的环节之一，从创伤早期炎症反应、肉芽组织的形成到机体组织的重建和瘢痕形成都离不开血管细胞的参与。血管内皮生长因子(VEGF)是血管生成过程中最重要的正向调控因子，在肿瘤生长及转移、创伤愈合和增生性瘢痕、瘢痕疙瘩等病理过程中可过量表达。VEGF在青光眼术后滤过瘢痕形成过程中的重要作用被动物和临床实验所证实，但目前有关青光眼术后滤过泡瘢痕形成过程中VEGF动态变化的相关研究鲜有报道。本实验通过双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫组织化学染色方法，明确VEGF在小梁切除术后滤过泡组织中的动态表达情况，旨在从分子水平进一步探讨瘢痕化发生机制，扩展治疗思路。
　　 虽然VEGF是目前最强的新生血管因子，但仅考虑VEGF的促血管生成作用还不足以完全解释其促瘢痕化作用，TGF-β已经被证实是目前在机体创伤修复进程中起到最关键调控作用的细胞因子，体外研究发现，TGF-β可以刺激VEGF的表达，进而促进血管形成。由此推测二者在小梁切除术后滤过泡瘢痕化的发生发展中可能存在一定的相互作用关系，本实验通过观察VEGF与TGF-β2在小梁切除术后滤过泡组织中的动态表达情况，探讨二者在滤过泡瘢痕形成过程中的相互作用关系，为提前预防滤过泡瘢痕化，提高手术成功率提供理论依据。
　　 Avastin是全长的人源化VEGF单克隆抗体，可与VEGF的所有异构体结合从而抑制VEGF的生物学活性而起作用[5]，已有报道其在抑制滤过泡纤维化中有显著作用和优越性，但作用的具体机制仍未明确，其注射时机、给药剂量、给药次数等仍缺乏临床规范。本实验通过观察不同浓度的Avastin对兔小梁切除术后滤过泡瘢痕化的抑制作用及对滤过泡组织中VEGF和TGF-β2的影响，初步探讨Avastin的作用机制，为抑制滤过泡瘢痕化提供理论基础，有利于制定完善的临床用药规范。
　　 第一部分：VEGF和TGF-β2在兔眼青光眼小梁切除术后滤过泡的表达
　　 [目的]以青紫蓝兔为动物模型，观察VEGF在兔眼小梁切除术后滤过泡瘢痕形成过程中的动态表达，探讨VEGF在的兔眼小梁切除术后滤过泡瘢痕形成过程中的作用及与TGF-β2的相关性。
　　 [方法]28只青紫蓝兔随机分为7组，随机选取1眼行小梁切除术，另1眼术作为对照，于术前和术后1，3，5，7，14，21d观察滤过泡瘢痕化情况，通过常规HE染色显示兔眼小梁切除术后滤过泡形态变化，免疫组织化学方法显示滤过泡组织中VEGF及TGF-β2的表达，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测量滤过泡组织中VEGF及TGF-β2的含量。采用两个重复测量因素的方差分析比较实验组与对照组、不同时间VEGF及TGF-β2的含量的差异，并应用Pearson相关分析比较VEGF及TGF-β2的相关性。
　　 [结果]术后实验组中VEGF含量随手术后时间变化明显呈峰值改变，术后第1天含量即增加，术后第5天到达峰值，随后逐渐下降。对照组与实验组比较，VEGF含量差别具有统计学意义(P=0.000)，不同时间点差别具有统计学意义(P=0.000)。术后实验组中TGF-β2随手术后时间变化明显呈峰值改变，术后第1天即明显增加，术后第7天到达峰值，以后含量仍呈升高趋势至21d。与相应对照组比较，实验组差别具有统计学意义(P=0.012)。不同时间点差别具有统计学意义(P=0.000)。术后滤过泡组织VEGF和TGF-β2含量具有相关性(Pearson相关系数为0.885，P=0.019)。
　　 [结论]青光眼小梁切除术后滤过泡组织内VEGF的含量明显增加，与瘢痕化进程一致，提示VEGF在滤过泡瘢痕形成过程中发挥了重要的作用，且与TGF-β2含量有相关性。
　　 第二部分：Avastin抑制兔眼青光眼小梁切除术后滤过泡VEGF和TGF-β2的实验研究
　　 [目的]验证Avastin抑制兔眼青光眼小梁切除术后滤过泡瘢痕化的作用，并与MMC、5-氟尿嘧啶相比较，观察不同浓Avastin对兔眼青光眼小梁切除术后滤过泡VEGF和TGF-β2含量的影响。
　　 [方法]选取青紫蓝兔20只，共40眼，随机分为A、B、C实验组和D空白对照组，每组10只眼，均行常规青光眼小梁切除术。A、B实验组于术毕滤过泡旁球结膜下分别注射1.25mg、2.5mgAastin，C实验组术中0.25mg/ml丝裂霉素结膜及巩膜瓣下湿棉片贴敷，空白对照组采用等量平衡盐液结膜下注射。在术后3、7天裂隙灯显微镜观察并比较不同处置眼的滤过泡形态和功能、不良反应及并发症。术后第7天光镜下计数滤过道平均每高倍镜视野成纤维细胞的数量，比较各组维细胞的增殖情况。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测量滤过泡组织中VEGF及TGF-β2的含量。
　　 [结果]术后第7天，A、B、C实验组和D空白对照组光镜下计数滤过道平均每高倍镜视野成纤维细胞的数量分别为27.9±4.1、20.6±3.2、22.6±3.3、49.4±4.9，B组成纤维细胞的数量最少，D组最多，B和C两者之前没有显著性差异(p=1.000)。术后第7天，滤过泡VEGF含量由低到高依次为B、A、C、D组，且任意两组间差异均有统计学意义(p＜0.05)。术后第7天，B、C组滤过泡中TGF-β2含量低于A组和对照组，A组低于对照组，差异有统计学意义(p=0.000)，B、C组间差异无统计学意义(p=1.000)。
　　 [结论]Aastin对滤过泡VEGF和TGF-β2的表达均有明显地抑制作用。术后结膜下注射Aastin可有效抑制兔眼青光眼小梁切除术后滤过泡瘢痕化，其中2.5mg作用优于1.25mg，且抑制VEGF的作用强于术中0.25mg/mlMMC结膜下敷贴和术后5-氟尿嘧啶结膜下注射，但对TGF-β2的抑制作用两者相当。

目录

摘要

引言

第一部分 VEGF在兔眼青光眼小梁切除术后滤过泡的表达及其与TGF-β2的相关性研究

1．材料与方法

2 结果

3．附图

4．讨论

第二部分 Avastin抑制兔眼青光眼小梁切除术后滤过泡瘢痕化和的实验研究

1．材料与方法

2．结果

3．附图

4．讨论

全文结论

参考文献

攻读学位期间成果

致谢

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