重型β-地中海贫血患儿异基因造血干细胞移植后的免疫恢复

摘要

研究背景：
　　 异基因造血干细胞移植(allogenic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)仍然是治愈遗传性血红蛋白病如重型β地中海贫血(Thalassemia Major，TM)患儿的唯一手段，但其临床应用受到以下因素的限制，如预处理的相关毒性，供者细胞对受者细胞抗原的免疫反应引起的移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)及延迟的免疫重建或免疫缺陷导致感染，复发及偶尔的排斥等等。造血干细胞移植后的免疫重建在成人已有较为深入的研究，但对于儿童研究很少。经过大剂量的化疗后，受者免疫细胞的大量减少，但受者浆细胞往往可能持续存在至移植后数月到数年。移植前许多因素也可影响移植后的免疫状态及其恢复，如年龄，干细胞来源，组织相容性抗原(histocompatibility antigen，HLA)相合的程度等等。移植后的急性GVHD，巨细胞病毒感染(cytomegalovirus，CMV)，免疫抑制剂应用、抗菌素，免疫球蛋白的应用及供者的淋巴细胞输注(donor lymphocyte infusions，DLI)等均可影响移植后免疫的恢复。提高移植后的免疫重建是决定其临床治疗效果的重要因素。我们研究在TM的儿童在清髓性的allo-HSCT后2年内的T细胞亚群及体液免疫的恢复及其相关影响因素。
　　 研究目的：
　　 本课题旨在探讨TM儿童在异基因外周血造血干细胞移植后2年内的免疫恢复情况，评估CMV感染对T细胞亚群的影响，评估不同的供者年龄和受者年龄对体液免疫的恢复的影响，从而评估免疫细胞在造血干细胞移植中可能的作用，期望通过该研究为移植后免疫重建的快速恢复，减少移植后感染死亡提供指导意义。
　　 方法：
　　 我们回顾性的分析在南方医科大学南方医院儿科层流病房进行外周血造血干细胞移植的地贫患儿免疫恢复情况。
　　 第一部分：移植后T细胞亚群的研究对象和方法
　　 第一节:移植后半年的T细胞亚群的研究对象和方法
　　 1.1)对于半年内的T细胞亚群的研究对象，入选研究范围的标准是:2009年3月至2011年6月内所有在我中心的地中海贫血患儿行非亲缘外周血造血干细胞移植的对象，在移植后半年的随访期间内未发生死亡或排斥，半年时完成T细胞亚群8项（包括CD3+、CD4+、CD8+、NK、CD4+CD45RA+、CD4+CD29+、CD8+CD28+、CD8+CD28-这八项）和血常规的评估，移植后截止于2012年1月仍无病存活的病例。共有40例患儿，其中CMV感染有20例。评估其免疫恢复情况和CMV对其的影响。
　　 1.2)预处理方案
　　 患儿均给予清髓性的预处理方案，包括环磷酰胺（cyclosphosphamide，Cy）100-120mg/kg，d-10至d-9分两天静脉滴注，氟达拉滨(fludarabine，Flu)，200mg/m2，-6至-2天分5天静脉滴注，塞替哌(thiotepa，TT)，10mg/kg，-5天1天分两次静脉滴注，白消安(buslfan，BU)，9.6-17.6mg/kg，分3-4天静脉注射(-8至-6天)。所有患儿给予环孢素A(cyclosporineA)，霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)和ATG（-3--1天）预防GVHD。短疗程的甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)在移植后第1，3，6天分别给予15，10and10mg/m2治疗。肝素钠预防肝静脉阻塞综合症(hepatic veno-occlusive disease，VOD)。
　　 1.3)移植前及移植后检测及预防巨细胞病毒定量
　　 移植前常规进行更昔洛韦(10mg/kg)治疗，疗程8-10天。在allo-HSCT后中性粒细胞数＞0.5×109/L开始每周监测CMV-DNA复制数，直到100天，移植后1月开始，常规进行每月7天的或每2月10天的预防性更昔洛韦治疗。CMV感染定义为在外周血中可监测到病毒的复制数，即＞500/ul。更昔洛韦的剂量或改用磷甲酸钠会依据患儿的肾功能和外周血中性粒细胞数进行调整，如外周血中性粒细胞数连续2天小于0.5×109/L停止更昔洛韦。
　　 1.4)植入的标准:移植后28天，第二个月，适当时甚至更长时间的检测植入证据。
　　 间接指标:移植后临床存活21天;各系统造血恢复正常，包括红系，粒系，淋巴系，巨核系等，中性粒细胞数在0.5×109/L，血小板数维持在20×109/L;临床上出现GVHD。肿大的肝脾回缩至正常大小;乳酸脱氢酶降至正常水平。
　　 直接指标:供受者性别不同采用免疫荧光原位杂交法(fluorescence in situhybridization，FISH)检测性染色体的转变，供受者性别相同采用短串联重复序列(variable number of tandem repeat，VNTR)（HLA抗原转变成供者型，或供者基因占受者的比例）。
　　 1.5)统计分析
　　 应用SPSS13.0软件进行统计分析，移植后巨细胞病毒感染与否与半年内的T细胞亚群的恢复的影响。先采用单个样本T检验对各个T细胞亚群数量与设定的参考值进行比较，然后将患儿按有无CMV感染分组，采用独立two-samplestTest检验方法比较。组间的基础指标的分类变量采用卡方比较，等级资料可采用独立样本的非参数检验（Mann-Whitney），定量变量采用2个样本的t检验比较。采用线性相关分析分析T细胞亚群CD8+细胞之间的相关性。P值小于0.05为有统计学意义。
　　 第二节：移植后1年的T细胞亚群的研究对象和方法
　　 对于1年内的T细胞亚群的研究对象，入选研究范围的标准是:2009年3月至2011年1月内在我中心的地中海贫血患儿行非亲缘外周血造血干细胞移植的对象，在移植后1年以上的随访期间内未发生死亡或排斥，移植后截止于2012年1月仍无病存活的病例，移植后1年完成T细胞亚群4项（至少包括CD3+、CD4+、CD8+、NK这四项）及血常规的评估。病人共有38例。对其病毒的检测与植入检测同上。应用SPSS13.0软件进行统计分析，采用单个样本t检验对各个T细胞亚群数量与设定的参考值进行比较。P值小于0.05为有统计学意义。
　　 第二部分：移植后体液免疫的研究对象和方法
　　 第一节：移植后半年的体液免疫的研究对象和方法
　　 对于半年内的体液免疫的研究对象，入选研究范围的标准是:2010年3月至2011年6月内所有在我中心的地中海贫血患儿行外周血造血干细胞移植的对象，在移植后半年的随访期间内未发生死亡或排斥，半年时完成体液免疫的免疫评估，移植后截止于2012年1月仍无病存活的病例，病人共有35例。对其病毒的检测与植入证据检测同上。应用SPSS13.0软件进行统计分析，先采用单个样本t检验对各个年龄段的体液免疫与设定的参考值进行比较，患儿年龄，供者年龄与移植后半年内体液免疫的恢复的影响，采用双变量的Pearson相关分别分析。P值小于0.05为有统计学意义
　　 第二节：移植后1年的体液免疫的研究对象和方法
　　 对于1年内的体液免疫的研究对象，入选研究范围的标准是:2009年3月至2011年1月内所有在我中心的地中海贫血患儿行外周血造血干细胞移植的对象，在移植后1年的随访期间内未发生死亡或排斥，移植后1年完成体液免疫评估，移植后截止于2012年1月仍无病存活的病例。病人共有35例。对其病毒的检测与植入证据检测同上。应用SPSS13.0软件进行统计分析，采用单个样本t检验对各个年龄段的体液免疫与设定的参考值进行比较。P值小于0.05为有统计学意义。
　　 结果：
　　 第一部分：T细胞亚群的情况
　　 第一节：移植后半年的T细胞亚群的恢复
　　 (1)半年的T细胞亚群内CD3+细胞的均值1.46×109/L,NK细胞均值0.33×109/L，CD4+细胞均值0.25×109/L，CD8+细胞均值1.14×109/L，其中CD4+细胞低于设定参考值0.5×109/L水平(t=-6.874，P＜0.001)。
　　 (2)CMV感染组的半年CD3+、CD8+、CDS+CD28-的细胞数分别为1.87±1.47×109/L、1.51±1.27×109/L、1.20±1.13×109/L，明显高于巨细胞病毒未感染组，其细胞数分别是1.05±0.60×109/L、0.78±0.50×109/L、0.51±0.41×109/L（分别为t=-2.315，P=0.029;t=-2.414，P=0.024;t=-2.540，P=0.018;），其两组的CD8+CD28-比率分别是46.17％±19.68％，33.32％±12.50％(t=-2.465，P=0.018)。
　　 (3)在CMV感染组内，CD8+细胞与CD8+CD28-细胞呈线性正相关(r=0.980，P＜0.001)，而与CD8+CD28+T细胞数负相关，但无直线线性相关(r=0.585，P=0.007)。
　　 第二节：移植后1年以上的T细胞亚群的恢复
　　 地中海贫血患儿在造血干细胞移植后1年以上T细胞亚群内CD3+细胞的均值2.22×109/L，NK细胞均值0.27×109/L，CD4+细胞均值0.63×109/L。
　　 第二部分：体液免疫的情况
　　 第一节：移植后半年的体液免疫恢复
　　 (1)地中海贫血患儿移植后半年的免疫球蛋白水平，3-6岁的IgA、IgM，IgG的平均值和标准差分别是0.40±0.22g/L、0.71±0.35g/L、7.17±2.30g/L，其中IgA、IgM恢复低于正常同龄儿童水平(分别t=-8.467，P＜0.001;t=-2.305，P=0.042)，＞7岁的IgA、IgM，IgG的平均值和标准差分别是0.81±0.71g/L、1.02±0.40g/L、8.13±3.28g/L，均低于正常同龄儿童水平(分别t=-2.305，P=0.042;t=-6.161,P＜0.001;t=-2.733,P=0.019)。
　　 (2)移植后的抗体水平和供者年龄无关，但患儿年龄分别与IgA，C3，C4的水平成正相关关系，相关系数分别是0.667、0.511、0.341，P值分别＜0.001、0.002、0.045。
　　 (3)2例脾切除后的患儿在造血干细胞移植后半年内的IgA、IgM，IgG的平均值分别1.58g/L，0.76g/L，14.25g/L。
　　 第二节：移植后1年以上的体液免疫恢复
　　 1年后地贫患儿的3-6岁的IgA，IgG，IgM的均值和标准差分别是0.83±0.40g/L、9.81±2.92g/L、0.86±0.27g/L，＞7岁的IgA，IgG，IgM的均值和标准差分别是1.35±0.74g/L、11.45±4.85g/L、1.05±0.53g/L。两年龄段IgM低于正常同龄儿童(t分别为-8.982，-5.380，P均为＜0.001)。
　　 结论：
　　 (1)TM儿童allo-HSCT后半年时NK细胞数比率及CD4+细胞数和比率不受CMV感染与否的影响，除了CD4+细胞数低于0.5×109/L外，其余均恢复正常。但一年后的患儿的T细胞各亚群处于正常参考值水平。
　　 (2)TM儿童allo-HSCT后的巨细胞病毒感染会导致高的CD8+细胞中的CD8+CD28-细胞的单克隆扩增，从而改变T细胞亚群的之间的转化率，且CD8+细胞升高比率与CD8+CD28-比率呈直线线性相关。
　　 (3)对于TM儿童allo-HSCT后半年时免疫球蛋白水平均低于正常同龄儿童，除了3-6岁的IgG水平外;同时患儿年龄与IgA，C3，C4的恢复成正相关。
　　 (4)对于TM儿童allo-HSCT后1年时免疫球蛋白水平均恢复至正常同龄儿童，除了IgM水平低于正常同龄儿童的外。
　　 (5)脾切除的TM患儿allo-HSCT后半年内有低的IgM水平和更高的IgG和IgA水平的趋势。

目录

摘要

前言

第一部分 重型地中海贫血造血干细胞移植术后的T细胞亚群的恢复

引言

研究对象和方法

结果

结论

讨论

第二部分 重型地中海贫血造血干细胞移植术后的体液免疫的恢复

引言

研究对象和方法

结果

结论

讨论

全文结论

不足之处

参考文献

综述

缩略语中英文对照

成果

致谢

声明

统计学证明