MicroRNA-338-3p前体及其抑制剂的慢病毒表达载体的构建和初步功能性分析

摘要

结直肠癌(colorectal carcinoma，CRC)是我国常见多发的恶性肿瘤之一，在我国城市和农村的发病率分别为常见恶性肿瘤的第四和第五位;而随着我国生活水平的日益提高和饮食习惯的相应转变，其总体发病率和死亡率近年来明显上升，且在经济发达的大中城市尤为明显，已接近西方发达国家水平。但目前我国CRC临床诊治效果仍不尽人意，5年生存率仅徘徊于40％-50％，而CRC术后复发转移是其治疗失败的主要原因。可见准确判断CRC早期转移倾向并抑制其恶性生物学进程，对提高CRC综合治疗效果具有重要的科学价值和社会意义;而国人CRC侵袭转移过程中分子特征的深入研究将为加强和促进我国CRC防治工作提供必要的理论基础。微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一类具有进化保守性的非编码小RNA，长约18-25个核苷酸，可通过与靶mRNA分子相互作用抑制其翻译或导致其直接降解来调控靶基因表达。MiRNA序列在进化上高度保守，提示miRNA可能对生命体的生长发育、增殖分化等基本生物学行为起着关键的调控作用;而近年来越来越多研究表明其失衡表达亦可促进多种人类疾病尤其是肿瘤的发生发展。目前已有超过800余种miRNA被发现定位并注册于miRNA数据库(miRBase)，且保守估计其至少参与约30％的人类转录后水平的蛋白表达调控。尽管多项研究业已证实miRNA的作用靶点涉及到人类肿瘤发生发展的各个阶段，但绝大部分miRNA与肿瘤相关的调控机制仍未完全阐明:且最新认识更考虑miRNA与其靶mRNA并不是简单的“一对一”直接线性关系，而是构成复杂的网络调控模式。鉴定差异表达的miRNA在肿瘤发生过程中的功能作用关键是明确肿瘤特异性相关的miRNA的作用靶点。了解miRNA在CRC发生发展中的分子调控机制有可能为这种常见的恶性肿瘤的早期诊治提供新的研究思路。MiR-338-3p是新近发现的一种miRNA;虽然有报道miR-338-3p在神经系统表达异常，但其在大部分肿瘤的发生发展中的功能作用却知之甚少。我们在前期实验中发现CRC中miR-338-3p表达水平较癌旁组织明显下降，提示miR-338-3p可能作为一种“抑癌基因”参与了CRC发生发展，但其在CRC中的作用靶点尚未见报道。Smoothened(SMO)作为一种G蛋白偶联受体相关蛋白，是Sonic hedgehog(Shh)信号通路的控制“开关”，其在CRC中表达异常增高且与肿瘤浸润增强、分期较晚、低分化趋势、肿瘤体积等生物学行为密切相关。同时SMO是于转录后水平上进行生理或者病理性表达调控;而我们应用生物信息学方法预测发现miR-338-3p与SMO mRNA3'非翻译区(untranslatedregion，UTR)存在互补结合位点。因此我们推测miR-338-3p可通过与SMOmRNA的3'-UTR区域互补结合而对其进行表达调控，从而调节CRC恶性生物学行为。为了验证该假说，在本实验中我们首先构建了miR-338-3p正义序列及其特异性抑制剂的慢病毒表达载体，继而建立了稳定过表达及稳定低表达miR-338-3p的CRC亚细胞系;继而在此基础上，观察肿瘤细胞迁移能力及miR-338-3p可能调控的靶目标—SMO蛋白的表达状况，旨在阐明miR-338-3p对CRC迁移能力的影响及其分子调控机制。本研究分为两个部分：
　　 第一部分：MicroRNA-338-3p前体及其抑制剂的慢病毒表达载体的构建。
　　 目的：构建人microRNA-338-3p(hsa-miR-338-3p)前体及其抑制剂的慢病毒表达载体。
　　 方法：由miRBase数据库查找获得miR-338-3p成熟序列，设计目的基因片段并人工合成;将miR-338-3p正义序列或抑制剂序列和pLV-THM载体经双酶切后连接，产生pLV-THM-miR-338-3p或pLV-TH M-miR-338-3 p-inhibitor慢病毒表达载体，双酶切后测序鉴定，筛选阳性克隆;以pLV-THM-miR-338-3p或pLV-THM-miR-338-3p-inhibitor、psPAX2和pMD2.G质粒共转染包装细胞HEK-293T，包装产生慢病毒并测定滴度。利用慢病毒感染SW-620细胞系，流式细胞仪筛选稳定过表达miR-338-3p及其抑制剂的SW-620亚细胞系，应用Real-time RT-PCR检测细胞中miR-338-3p表达状况。
　　 结果：经双酶切鉴定和测序证实，成功构建了包含miR-338-3p及其抑制剂的慢病毒表达载体，倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞HEK-293T表达绿色荧光。稳定过表达miR-338-3p的SW-620亚细胞系中，miR-338-3p表达水平高于阴性对照组和未处理组，差异具有统计学意义(P＜0.01);而稳定过表达miR-338-3p抑制剂的SW-620亚细胞系中，miR-338-3p表达水平低于阴性对照组和未处理组，差异具有统计学意义(P＜0.01)。
　　 结论：成功构建了miR-338-3p前体及其抑制剂的慢病毒表达载体和稳定过表达及稳定低表达miR-338-3p的SW-620亚细胞系，为进一步深入研究miR-338-3p在CRC中生物学功能奠定了基础。
　　 第二部分：MicroRNA-338-3p对结直肠癌细胞迁移能力的影响。
　　 目的：观察miR-338-3p对CRC细胞迁移能力的影响。
　　 方法：pLV-THM-miR-338-3p和pLV-THM-miR-338-3p-inhibitor慢病毒表达载体的构建同前述，继而建立了稳定过表达miR-338-3p及其抑制剂的SW-620亚细胞系。应用Real-time RT-PCR检测肿瘤细胞中miR-338-3p表达水平，Western-blot检测SMO蛋白表达状况，Transwell小室穿透实验检测肿瘤细胞的迁移能力。
　　 结果：稳定过表达miR-338-3p的SW-620亚细胞系中，miR-338-3p表达水平高于阴性对照组和未处理组，SMO蛋白表达水平下降，且肿瘤细胞表现出迁移能力的减弱，差异具有统计学意义（P＜0.01）;而稳定过表达miR-338-3p抑制剂的SW-620亚细胞系中，miR-338-3p表达水平低于阴性对照组和未处理组，SMO蛋白表达水平升高，且肿瘤细胞表现出迁移能力的增强，差异具有统计学意义(P＜0.01)。
　　 结论：MiR-338-3p可能是通过抑制CRC细胞中SMO蛋白表达而抑制肿瘤细胞迁移。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 MicroRNA-338-3p及其抑制剂的慢病毒表达载体的构建

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第二章 MicroRNA-338-3p对结直肠癌细胞侵袭转移能力的影响

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

英文缩写注解

攻读博士学位期间研究成果

致谢

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