白纹伊蚊嗅觉结合蛋白的克隆、鉴定和功能分析

摘要

研究背景:蚊是一类重要的医学昆虫，不仅叮咬骚扰人类，同时还可能传播多种疾病，如疟疾、丝虫病、登革热、流行性乙型脑炎、黄热病等，对人类的健康产生极大的危害。蚊媒病流行范围广，传播力强，发病率高，全球每年有上亿人感染疟疾、登革热等蚊媒病，死亡人数过百万。据统计，在世界范围内，每年有成百上千万人感染疟疾，每年有多达一百万的儿童死于疟疾，疟疾的流行给人类造成了巨大灾难并带来难以承受的经济负担[1]。在我国每年也因为蚊子的叮咬而发生多种疾病，蚊媒传染病仍然是威胁人们健康的主要因素之一[2，3]。媒介蚊虫防制是控制蚊媒传染病流行的重要措施。目前，对于登革热、黄热病、西尼罗病毒病等蚊媒病毒传染病尚无特效治疗方法或特异性预防手段，而疟原虫对传统药物抗药性也逐渐凸显，媒介控制在预防其发生和流行方面的重要性就显得更加突出，而寻求有效的控制方法则成为世界医学界面临的重要课题。虽然媒介化学防制由于其突出的效果在蚊媒防制中一直占有统治地位，但是化学农药所造成严重的环境污染，易引起蚊虫药物抗性的产生等弊端日益显现，因此，控制蚊虫的种群数量和密度，从而减少蚊媒传染病的发生率和死亡率则显得意义重大。蚊虫对周围环境的识别，主要依赖于自身的感官系统，如嗅觉系统、味觉系统等。对嗅觉系统的深入研究，有利于我们了解蚊虫的生活习性，同时也有利于我们探讨各种不同的化合物对蚊虫的趋避活性。
　　 白纹伊蚊要进行生存与繁殖，其行为在很大程度上依赖于嗅觉系统。近年来，国际上在蚊嗅觉结合蛋白领域取得了一些突破性的进展，如在致倦库蚊（Culex quinquefasciatus）、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)和埃及伊蚊(Aedesaegypti)中已经发现的经典OBPs(classic OBPs)分别有33，34和55个[4-6]。尽管如此，由于白纹伊蚊的基因组序列还未公布，限制了对该种蚊属的全方位研究，尤其对白纹伊蚊嗅觉系统的研究，包括对嗅觉结合蛋白和嗅觉受体的了解都知之甚少。
　　 研究目的:本课题研究拟初步探讨白纹伊蚊嗅觉系统的主要组成成分之一—嗅觉结合蛋白(OBP)，通过实验室研究分析其分子结构特征，掌握其时空特异性表达谱，探讨其在白纹伊蚊嗅觉发生过程中的重要作用，阐明嗅觉结合蛋白对气味分子的识别作用及其调控的分子机制，从而为新型的、环保的、高效的蚊引诱剂或驱避剂的筛选奠定科学的理论基础。
　　 研究方法:
　　 1.对部分白纹伊蚊基因组DNA序列进行测序分析（此部分由陈晓光教授等完成）;
　　 2.利用tBLASTn的方法，以埃及伊蚊OBPs的氨基酸序列作为索引，对白纹伊蚊基因组DNA序列进行同源比对比对分析;
　　 3.通过RACE法，利用巢式PCR(nest PCR)扩增白纹伊蚊OBP的全长cDNA序列(包括其N端的非编码序列(untranslated region，UTR)与C末端的PolyA终止序列）;
　　 4.对所获得的白纹伊蚊OBPs进行一系列的分子生物信息学分析，如预测OBPs的分子量、等电点(isoelectric points，IP)和N端的信号肽(signal peptides，SP)及其长度;
　　 5.利用网络数据库分析OBP蛋白的保守结构域(conserved domains database，CDD)及进行氨基酸序列比对，分析它们的分子结构特征;
　　 6.利用软件MEGA4.0对白纹伊蚊OBP进行系统进化树分析，分析它们与及埃及伊蚊、冈比亚按蚊、致倦库蚊OBP的亲缘关系;
　　 7.通过RT-PCR，分析白纹伊蚊OBP的组织特异性表达谱（触角、喙、下颚须、足和躯干），同时还分析了AalbOBP37和AalbOBP39的时间表达谱和性别特异性表达谱;
　　 8.构建原核表达载体pET-22(b)-OBP37和pET-22(b)-OBP39，并进行PCR鉴定和测序分析;
　　 9.靶标蛋白AalbOBP37和AalbOBP39的诱导表达、纯化，并通过SDS-PAGE和western blot鉴定;
　　 10.通过软件SwissPdb Viewer programme“Deep-View”分析靶标蛋白OBP37和OBP39的3D空间结构;
　　 11.蛋白-荧光配体结合分析实验(Fluorescent binding assay)分析靶标蛋白OBP37和OBP39与不同气味分子的亲和力，同时还分析靶标蛋白OBP37和OBP39在不同pH环境中与配体吲哚(indole)的亲和能力;
　　 12.通过胸腔注射靶标基因OBP37和OBP39的dsRNA，进行RNA干扰(RNAinterference，RNAi)，并通过荧光定量PCR检测RNAi的效果;
　　 13.触角电位（Electroantennogram，EAG）分析白纹伊蚊对不同化合物的识别能力;14.通过RNAi将靶标基因OBP37和OBP39 knockdown以后，检测RNAi前后白纹伊蚊EAG的改变;
　　 15.Y型迷滓管实验分析白纹伊蚊对不同化合物的行为反应;
　　 16.通过RNAi将靶标基因OBP37和OBP39 knockdown以后，Y型迷津管实验分析白纹伊蚊对气味分子indole的识别能力是否有改变。
　　 研究结果:
　　 1.通过测序，我们得到了部分白纹伊蚊的基因组DNA序列;
　　 2.得到了与埃及伊蚊OBP基因序列同源性最高的白纹伊蚊基因组DNA序列;
　　 3.以这些DNA序列作为模板，设计5'和3'RACE nest PCR引物;成功获得了21个白纹伊蚊OBP基因的全长eDNA序列，包括5'和3'非编码基因序列;
　　 4.生物信息学分析得知:21个白纹伊蚊OBP基因都属于小分子蛋白，分子量介于15 kDa～28 kDa之间;其中有14个OBPs基因含有信号肽，信号肽长度为17aa～25aa，而另外7个OBPs无信号肽;
　　 5.CDD分析可知含有信号肽的14个OBPs基因属于PBP_GOBP家族;序列比对分析结果表明属于PBP_GOBP家族的14个OBPs基因为经典的OBPs(classic OBPs):即含有六个保守的半胱氨酸残疾结构;而另外7个OBP基因为Plus-C家族的OBPs:即六个保守的半胱氨酸残基，还有2个额外的保守半胱氨酸残基(C4a和C6a)一个保守的脯氨酸残基;
　　 6.系统进化树分析可知白纹伊蚊与埃及伊蚊OBP的亲缘关系最近，同时14个Classic OBP又被分为六个组:OS-E/OS-F组、PRPBP1组、PRPBP4组、GroupA组、Group B组和LUSH/OBP19a组，其中OBP37和OBP39属于OS-E/OS-F组;
　　 7.组织特异性表达谱结果显示21个白纹伊蚊OBPs在不同的组织中的表达情况不同，其中OBP37和OBP39为触角特异性表达的OBP;同时我们还发现OBP37和OBP39在白纹伊蚊羽化后第一、二天出现弱表达，且表达水平随着时间的增加而升高;另外，OBP39在雌蚊触角中的表达水平远远高于在雄蚊，差异显著，具有统计学意义(actin:t=-68.128，P＜0.001; rpS6:t=-11.142，P=0.008)，而AalbOBP37在雌雄蚊触角中的表达无统计学差异(actin:t=0.214, P=0.085,rpS6: t=0.254, P=0.823);
　　 8.成功构建表达载体pET-22(b)-OBP37和pET-22(b)-OBP39;
　　 9.成功诱导靶标蛋白AalbOBP37和AalbOBP39在原核系统内表达，通过SDS-PAGE和western blot证实:靶标蛋白未被分泌至细胞内，在细菌体内以两种形式存在:同时以包涵体和可溶性蛋白的形式存在;成功回收经鉴定的可溶性靶标蛋白;
　　 10.通过软件SwissPdb Viewer programme“Deep-View”分析靶标蛋白OBP37和OBP39的空间结构得知:白纹伊蚊OBP39的分子结构与冈比亚按蚊、致倦库蚊和埃及伊蚊的OBP1极为相似，故推测白纹伊蚊OBP39的功能与其它三属蚊OBP的功能相似;白纹伊蚊OBP37的结构与OBP39亦极为相似，所以OBP37亦可能具有与OBP39相似的功能;
　　 11.通过Fluorescent binding assay，白纹伊蚊OBP37和OBP39能与配体吲哚(indole)、3-甲基吲哚(skatole)、避蚊胺(DEET)和1-辛烯-3-醇（1-octen-3-ol）结合;同时，OBP37和OBP39在酸性环境(pH=4.5)中与配体indole的结合力较中性环境(pH=7.4)弱;
　　 12.通过RNAi，成功将靶标基因AalbOBP37和AalbOBP39的表达水平knockdown;
　　 13.EAG结果显示indole、skatole、DEET和1-octen-3-ol能够触发白纹伊蚊触角产生动作电位，且随着化合物浓度的增加而增强;
　　 14.通过RNAi成功knock down靶标基因OBP37和OBP39的表达水平后，与对照组相比较，实验组的EAG显著下降，总体差异显著，具有统计学意义(F=22.454，P＜0.001);
　　 15.行为实验结果显示indole、skatole和1-octen-3-ol对白纹伊蚊具有引诱作用，而DEET对白纹伊蚊具有趋避作用;
　　 16.通过RNAi成功knock down靶标基因OBP37和OBP39的表达水平后，行为实验证实干扰组蚊虫对气味分子indole的趋化活性低于对照组，总体差异显著，具有统计学意义(F=22.465，P＜0.001)。
　　 结论:
　　 1.首次成功克隆、鉴定了21个白纹伊蚊OBP基因;
　　 2.靶标蛋白OBP37和OBP39以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在于细菌体内;
　　 3.白纹伊蚊OBP的表达具有时空特异性;OBP37和OBP39属于触角特异性表达的OBPs;
　　 4.RNAi成功knock down白纹伊蚊OBP37和OBP39的表达水平;
　　 5.白纹伊蚊OBP37和OBP39与气味分子的结合能力受到pH的影响;
　　 6.白纹伊蚊OBP37和OBP39影响EAG，同时影响其对气味分子的识别能力。

目录

摘要

前言

第一章 白纹伊蚊嗅觉结合蛋白的克隆、鉴定

1 材料

1．1 菌株和质粒

1．2 实验用白纹伊蚊及其饲养

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器

1．5 本章使用的引物

1．6 溶液及培养基的配置

2 实验方法

2．1 总RNA的提取

2．2 RACE-ready cDNA的合成

2．3 引物的设计与合成

2．4 目的基因的PCR扩增

2．5 目的基因的连接、测序

3 结果

3．1 白纹伊蚊OBP的同源性比较及其命名

4 讨论

小结

第二章 AalbOBP基因的表达谱分析及生物信息学分析

1 材料

1．1 实验用白纹伊蚊及其饲养

1．2 主要试剂和主要软件

1．3 主要仪器

1．4 本章使用的引物(RT-PCR)

1．5 溶液的配置

2 实验方法

2．1 RT-PCR引物的设计及合成

2．2 成蚊不同组织总RNA的提取

2．3 第一链cDNA的合成

2．4 RT-PCR

2．5 生物信息学分析

2．6 分子模型的建立

2．7 本章使用的统计学方法

3 结果

3．1 表达谱分析

3．2 生物信息学分析

3．3 分子模型的建立

4 讨论

4．1 表达谱

4．2 生物信息学分析

4．3 分子模型分析

小结

第三章 表达载体的构建及目的蛋白的表达、纯化

1 材料

1．1 实验用菌株和质粒

1．2 实验用动物及白纹伊蚊

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器

1．5 溶液及培养基的配置

1．6 本章使用的引物

2．实验方法

2．1 总RNA的提取及逆转录

2．2 目的基因的PCR扩增、回收及测序

2．3 表达载体的构建

2．4 目的蛋白的表达及其纯化

2．5 Western blot分析

3 结果

3．1 靶标载体的测序鉴定

3．2 表达载体的构建及其鉴定

3．3 目的蛋白的表达及其鉴定

3．4 目的蛋白的western blot分析

3．5 目的蛋白的纯化、回收

4 讨论

小结

第四章 目的蛋白的功能分析

1 材料

1．1 实验用白纹伊蚊及其饲养

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

1．4 DNA电泳缓冲液的配置

1．5 本章使用的引物

1．6 Fluorescence binding assay、EAG及行为实验相关试剂的配置

2 实验方法

2．1 双链RNA(dsRNA)的合成

2．2 RNA干扰(RNAi)

2．3 总RNA的提取及逆转录

2．4 荧光定量PCR(qRT-PCR)检测靶标基因

2．5 触角电位(EAG)

2．6 荧光配体结合分析(fluorescence binding assay)

2．7 行为实验

2．8 本章使用的统计学方法

3 结果

3．1 dsRNA合成后的鉴定

3．2 RNAi效果的检测

3．3 EAG结果

3．4 Fluorescence binding assay

3．5 行为实验

4 讨论

4．1 RNAi

4．2 EAG

4．3 Fluorescence binding assay

4．4 行为实验

小结

参考文献

综述 蚊嗅觉结合蛋白和嗅觉受体的研究进展

缩略词汇表

博士期间成果

致谢

声明

统计学审稿证明