探讨NBD多肽在兔胫骨骨髓炎模型中抗炎及抗炎症性骨破坏作用

摘要

骨髓炎目前在临床上越来越常见，在创伤骨折中，用于固定的髓内针、钢板以及金属固定架引入的金属颗粒等可刺激细胞产生多种炎性因子导致持续的炎症反应并直接影响骨折愈合，同样感染等细菌性炎症或其他因素导致的长期慢性炎症反应的存在，可导致骨折延迟愈合以及骨不连。并且随着抗生素的广泛应用或应用错误甚至滥用，使许多致病菌产生了抗药性，这加重了骨髓炎在治疗过程中容易出现失败效率高、感染高，治疗时间长，花费大的特点。骨折延迟愈合以及骨不连产生的疼痛、肢体功能和心理障碍等，给患者带来了极大的痛苦，同时也增加了患者和社会的经济负担。而骨形成过程就是骨骼中的成骨细胞活性与破骨细胞活性这一相互拮抗制约的矛盾统一体的平衡过程，如何快速有效的治疗骨髓炎成为骨科疾病治疗中迫切需要解决的问题之一。骨形成过程就是骨骼中的成骨细胞活性与破骨细胞活性这一相互拮抗制约的矛盾统一体的平衡过程，其中成骨细胞的作用为合成骨基质，由间充质干细胞(MSC)分化而来;破骨细胞的作用为降解骨基质，由骨髓单核巨噬细胞分化演变而成。骨折愈合过程中需要大量新的成骨细胞产生，从而加快骨质合成与钙化，增加骨的体积和密度。慢性持续性炎症可刺激骨吸收，此方面研究已较成熟。但慢性持续性炎症对骨形成过程中成骨细胞分化的影响，尤其是对间充质干细胞分化成为成骨细胞过程的影响至今却所知甚少，而阻止炎症因子对骨再生抑制的研究对指导临床实践具有重要意义。 核转录因子NF-κB(nuclear factor kappa B)作为一种重要的核内转录因子，参与免疫应答，炎性反应以及细胞凋亡等多种反应物质基因的表达调控，由于小分子NBD多肽抑制NF-κB必须调节蛋白(NF-κB essentialmodifier，NEMO)与IKKa和IkKβ的结合，从而抑制IKK激活，阻止破骨前体细胞转化为功能性破骨细胞从而抑制炎症性骨吸收，同时阻断NF-κB通路对成骨细胞分化的抑制等作用从而恢复成骨细胞与破骨细胞的平衡，而且不影响NF-κB的基础生理功能，进而调节机体的炎症反应、免疫应答和细胞生长周期。目前国际上对于NBD多肽的研究大部分在细胞水平，也有NBD多肽治疗溃疡性结肠炎及胰腺炎等试验性的动物研究，虽然已有试验证明NBD多肽在炎症刺激下对破骨细胞的抑制及对促进成骨细胞分化的研究，但鲜有对动物骨髓炎模型方面的研究，因此需要我们进一步深入研究。 本实验旨在对兔胫骨干骺端注射一定量细菌悬液的方法建立胫骨骨髓炎模型后，通过局部注射NBD多肽于胫骨慢性骨髓炎病灶区来研究NBD多肽在动物模型下炎症环境中多肽抗炎及成骨效应。 第一章兔胫骨慢性骨髓炎动物模型的建立的研究 目的探讨兔胫骨骨髓炎的造模方法 方法健康新西兰大白兔16只，于兔小腿胫骨干骺端内侧做一长约2cm切口，暴露干骺端骨质后，电钻钻入1mm的克氏针，插入12号注射器针头抽取3ml骨髓液后并依此注入0.1ml5％鱼肝油酸钠及0.5ml0.5滴度金黄色葡萄球菌悬液，全身不预防应用抗生素，术后回笼饲养，3周后采用以下指标验证模型:①伤口周围肉眼大体一般情况;②兔右小腿胫骨侧位X线观察;③3周后随机处死3只，取局部病变组织行细菌培养及鉴定;④3周后取随机处死的实验兔病变胫骨组织用10％福尔马林固定，EDTA脱钙2月，制作石蜡切片后经苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察病理切片组织。 结果①一般情况观察:可见伤口周围肿胀，皮肤颜色苍白，按压肿块较软，且有波动感，伤口周围无毛发生长，轻轻触碰肿胀区域，动物有不适感。实验动物早期精神萎靡，食欲下降，且饮水量大增。②3周后行右胫骨X线观察，可见胫骨干骺端出现骨质坏死，有死骨形成，骨膜反应及软组织肿胀明显，并且不同医师行Norden评分，最后Norden评分平均为4.1±0.3≥3分。③病灶周围组织取材行细菌培养鉴定:3周后随机处死3只实验兔行胫骨病变组织取材，取材组织溶解于0.9％生理盐水中，再取少量涂于血浆培养基，放入培养箱中培养，48小时培养皿可见大量菌落形成，并对菌落行血浆凝固酶实验，实验结果提示所培养出的细菌均为金黄色葡萄球菌。④组织病理学观察:3只随机处死的实验兔中，取下右小腿胫骨病变组织，光镜下视野可见病理切片组织骨髓腔充满大量炎症细胞，并可见炎症细胞包围大量死骨组织的典型骨髓炎病理学表现。 结论:兔胫骨干骺端注射一定量的细菌悬浮液可以较好的建立慢性骨髓炎模型。 第二章探讨NBD多肽在兔胫骨骨髓炎模型中的抗炎效应 目的探讨NBD多肽在兔胫骨骨髓炎模型中的抗炎效应 方法健康新西兰大白兔21只，通过上述方法局部注射细菌悬液于兔胫骨干骺端来制备慢性骨髓炎模型，3周后将这些成功模型随机分为3组，每组7只，空白组:开6mm骨窗;对照组:开6mm骨窗+清创;治疗组:开6mm骨窗+清创+局部注射NBD多肽，分组后于第一周至第六周在兔耳缘静脉抽取静脉血行血沉、C反应蛋白及白血球细胞计数，并在第六周每组随机处死3只行病理学HE染色。 结果①分组后第4周三组CRP水平比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)，分组后第5周治疗组CRP水平与空白组、对照组比较具有统计学意义(P＜0.05)。分组前及分组后1～6周各组ESR水平比较无统计学意义(P＞0.05)。分组前及分组后1～6周各组白血球计数水平比较均具有统计学意义(P＜0.05)。②病理学表现:在第六周三组病理切片HE染色对比可见空白组切片中大量炎症细胞浸润并可见明显死骨，对照组少量炎症细胞浸润，很难找到死骨，而治疗组切片中无验证细胞浸润并可见髓腔中大量纤维增生。 结论:实验结果显示局部注射NBD多肽对兔胫骨慢性骨髓炎模型有一定抗炎的效应。 第三章探讨NBD多肽在兔胫骨骨髓炎模型中抗炎症性骨破坏效应 目的探讨NBD多肽在兔胫骨骨髓炎模型中的抗炎症性骨破坏及成骨效应。 方法健康新西兰大白兔21只，通过在兔胫骨干骺端局部注射注射金葡菌悬液来建立骨胫骨慢性骨髓炎，将成功造模的骨髓炎模型随机分为3组，空白组:干骺端开4mm的骨窗;对照组:干骺端开4mm骨窗+清创;治疗组:干骺端4mm骨窗+清创+局部注射NBD多肽，在第四、六周行兔右胫骨X线观察，并在第六周处死3组实验动物，取病变胫骨组织行病理HE染色及Micro-CT检查。 结果①X线观察可见空白组、对照组第六周骨窗明显可见，而治疗组骨窗比较模糊;②Micro-CT三维重建可见治疗组骨窗大小比空白组、对照组都缩小，并计算BV/TV相对百分比均有统计学意义;③病理HE染色可见治疗组骨窗周围新生成骨细胞明显，其余两组并无明显成骨细胞，同时空白组大量炎症细胞浸润，对照组纤维组织增生。 结论实验结果显示局部注射NBD多肽在兔胫骨骨髓炎模型中有一定的抗炎症性骨破坏作用及成骨效应。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 兔胫骨骨髓炎模型的制备

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 NBD多肽在兔胫骨骨髓炎模型中抗炎效应

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三章 探讨NBD多肽在骨髓炎模型中抗炎症性骨破坏效应

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文结论

NBD多肽的应用研究进展

英文缩略词表

致谢

声明