CT引导下经皮纤维环穿刺建立兔腰椎间盘退变模型

摘要

研究背景: 腰痛(Low Back Pain，LBP)是骨科临床上常见病和多发病，严重影响人类健康。60％-80％的成年人一生中均有过不同程度的腰痛病史，在任何时候均有15-20％的人群为腰痛所困扰;腰痛是失业、甚至致残的重要病因。腰痛病因复杂，其中最主要原因被认为是腰椎间盘退变性疾病。椎间盘退行性改变是腰椎诸多潜在病变的基础，但其引发腰痛的发病机制尚未完全了解。现代椎间盘病变的治疗不仅满足于常规的治疗方式，直接针对椎间盘退变的新型治疗方法，如向椎间盘内注射多肽或生长因子、基因治疗、细胞治疗、组织工程等，正成为国内外研究热点，亟需对椎间盘退变的发病机理、病理生理有更透彻的了解。故深入开展腰椎间盘退变的研究，对于腰痛的预防及治疗均具有重大的现实意义及社会意义。 椎间盘是人体最早最易随年龄而发生退行性变的组织。人类的椎间盘退变为数十年的漫长过程，影响因素较多，且涉及伦理学原则，目前难以在人体活体上直接进行椎间盘退变研究的实验。故建立一种可靠的椎间盘退变动物模型成为研究椎间盘退变发病机理及椎间盘退变药物治疗的必然之选。退变动物实验模型的使用，可在较短时间内获取所需的活体内退变椎间盘，且极大的方便了椎间盘组织取材、组织学分析，可准确了解椎间盘退变不同阶段的生理、生化变化情况，监测椎间盘退变药物治疗的效果。然而，获取理想的动物模型，除考虑动物椎间盘退变与人类相似性和可比拟性外，还要考虑到构模的可重复性、易操作性，及经济性等，不可违背动物实验的伦理学原则，故在实际操作上较困难。 鼠及兔是最常用于制作椎间盘退变模型的实验动物，而纤维环穿刺法诱导椎间盘退变是最常用的构建方式。多数学者倾向于开放手术破坏动物椎间盘组织，因其具有观察直观、效果确切、可重复性高等优点，但手术操作破坏较多的椎旁组织，导致实验动物创伤大、甚至影响实验效果。近年来，部分学者试图利用微创方法制作椎间盘退变模型，以减少因损伤椎间盘以外结构所造成的对实验结果的误判影响，同时降低了实验动物的死亡率。如有学者在透视引导下经皮纤维环穿刺或向纤维环注射药物成功诱导了椎间盘退变，此为椎间盘退变模型的构建提供了一新思路。但因其影像技术本身所限制，透视引导法仅能提供二维的平面图像，存在定位不准确、对椎间盘周围结构显示欠佳的缺点，操作时存在不便之处。 本研究探讨对实验动物创伤小、效果确切、操作便利的新造模方法:在CT引导下经皮穿刺纤维环建立兔腰椎间盘退变模型，在术前及术后4、8、12周进行X线平片及磁共振成像检查，并于术后的影像学检查结束后，处死实验动物，分离出椎间盘组织，并进行脱钙、染色，分析其大体形态、组织病理学、免疫组织化学改变，观察其造模后缓慢、连续退变效果的确切性;此研究为椎间盘退变的研究提供良好的微创动物模型、以后的新的治疗手段研究提供实验基础。 研究目的: 在CT引导下经皮纤维环穿刺建立兔椎间盘退变模型，并通过影像学和病理学验证其退变过程及效果。 研究方法: 1、实验动物:新西兰大白兔18只，3月龄，体重为2.7-3.3kg不等，雌雄不限。 2、实验分组:L5/L6椎间盘（兔髂棘连线头侧第一个椎间盘）为穿刺组，L4/L5椎间盘为假穿刺组，L3/L4椎间盘为对照组。 3、术前影像学检查:包括腰椎X线侧位片及磁共振矢状位T2加权成像。并观察排除腰椎畸形或腰椎间盘病变。 4、手术操作:连接双侧髂棘，并在皮下刺入22G针头，使之与髂棘连线平行，作为定位针头;在CT定位图上测量L5/L6目标椎间盘（双侧髂棘连线头侧第一个椎间盘）与定位针头两平面间的距离，并在体表上确定目标椎间盘平面，并作标记线。在侧方皮下、标记线下刺入22G针头，使之与标记线平行，在CT轴位图像上测量刺入L5/L6水平皮下穿刺针尾部与目标椎间盘中心的距离，并在体表上根据其距离确定目标椎间盘投影的大致位置;在螺旋CT引导下，经投影位置处刺入18G针头，并根据CT轴位图像调整穿刺针头的方向及位置，使穿刺针头准确抵达目标椎间盘边缘，针尖的延长线通过椎间盘中央;轻轻用力使针头刺入椎间盘纤维环，感觉到明显的落空感后，停止穿刺;在CT轴位图像下确认刺入椎间盘纤维环深度约5mm，抽出针头至椎间盘边缘，重复穿刺3次。以同样的方法对L4/L5椎间盘进行假性穿刺，即穿刺达椎间盘边缘，但不刺入纤维环内，L3/L4椎间盘作为对照椎间盘，不作任何处理。 5、退变效果检测:术后4周、8周、12周随机选取6只兔子进行影像学检查，观察腰椎X线侧位片上各组椎间隙高度、邻近骨质改变及椎间盘信号改变，以“术后椎间隙高度/术前椎间隙高度×100”计算椎间盘高度相对值(DHRV)，并对腰椎磁共振成像上各组椎间盘进行改良Thompson分级法分级;影像学检查结束24小时内处死动物，选取穿刺组、假穿刺组、对照组椎间盘进行大体形态、组织病理学及免疫组织化学、髓核蛋白多糖含量分析。 6、统计学分析:实验数据使用SPSS17.0统计学软件处理。DHRV值及蛋白多糖含量采用单因素的方差分析，采用SNK(Student-Newman-Keuls)法进行组间的比较。磁共振成像等级资料采用非参数秩和检验分析。P＜0.05为差异有统计学意义。 研究结果: 1、对照组及假穿刺组椎间盘: 术后4、8、12周，X线片示对照组及假穿刺组椎间隙高度未见降低，未见终板骨质硬化与骨赘形成，磁共振T2加权成像图像示各椎间盘均呈高信号，大体形态观察可见髓核呈白色胶冻样，外周纤维环呈同心圆层状，包绕髓核组织，分界清晰。组织病理学检查见髓核细胞数量较多，分布均匀，纤维环排列呈同心圆层状，免疫组化分析可见髓核呈Ⅰ型胶原染色阴性，Ⅱ型胶原染色强阳性，在各时间点表现无明显差别。在术后4、8、12周，髓核蛋白多糖含量分别为372.3±47.7、325.8±61.3、298.5±45.4μg/g，呈轻度下降趋势，但无统计学差异(P＞0.05)。 2、穿刺组椎间盘: ①穿刺组椎间盘在术后4周X线即可见椎间隙高度轻度降低（DHRV=70.78±4.55），磁共振成像显示穿刺组椎间盘信号轻度下降，改良Thompson分级Ⅱ级椎间盘数量为5个，Ⅲ级椎间盘数量为1个;大体形态观察见髓核水分下降，与纤维环分界不清，组织学上见纤维环结构紊乱，髓核细胞轻度减少。免疫组织化学分析见Ⅰ型胶原染色髓核呈淡黄色，Ⅱ型胶原染色呈中等程度的黄色。髓核蛋白多糖含量为233.9±16.6μg/g。统计学分析结果显示，与假穿刺组及对照组相比，穿刺组椎间盘DHRV值降低，改良Thompson分级增高，蛋白多糖含量降低，均具有统计学意义(P＜0.05)。 ②穿刺组椎间盘术后8周椎间隙高度明显降低(DHRV=50.63±4.04)，开始出现终板骨质硬化，磁共振成像显示椎间盘信号明显下降，改良Thompson分级Ⅲ级椎间盘数量为4个，Ⅳ级椎间盘数量为2个，大体形态观察见髓核组织明显萎缩，失去胶冻状外形，并见纤维环与髓核交界处较多的纤维组织，及少量软骨组织。组织学上，髓核被胶原组织分裂为含较多椭圆形细胞的细胞岛，出现纤维软骨细胞，纤维环层状结构变形、部分断裂。免疫组织化学分析见Ⅰ型胶原染色髓核颜色加深，呈黄色，Ⅱ型胶原染色呈淡黄色。髓核蛋白多糖含量为184.9±11.6μg/g。统计学分析结果显示，与假穿刺组及对照组相比，穿刺组椎间盘DHRV值明显降低、改良Thompson分级增高、髓核蛋白多糖含量降低，均具有统计学差异(P＜0.05);与术后4周相比，术后8周穿刺组椎间盘上述改变亦具有统计学差异(P＜0.05)。 ③术后12周穿刺组椎间隙高度继续下降（DHRV=44.78±2.61），骨赘形成、终板骨质硬化明显，磁共振成像示椎间盘信号继续下降，改良Thompson分级Ⅲ级椎间盘数量为1个，Ⅳ级椎间盘数量为5个，大体观察见髓核组织基本消失，被纤维组织、骨样组织所代替，在穿刺针入口处周围的纤维环边缘上可见明显的骨赘形成，组织学上见纤维环层状组织碎裂、解体，髓核被纤维软骨组织所代替。免疫组织化学分析见Ⅰ型胶原染色髓核呈较深的棕黄色，Ⅱ型胶原染色髓核组织染色非常淡薄，基本不染色。髓核蛋白多糖含量为143.5±8.5μg/g。统计学分析结果显示，与假穿刺组及对照组相比，穿刺组椎间盘DHRV值明显降低、改良Thompson分级增高、髓核蛋白多糖含量降低，均具有统计学差异(P＜0.05);与术后4周、8周相比，术后12周穿刺椎间盘上述改变具有统计学差异(P＜0.05)，提示穿刺椎间盘DHRV值呈进行性降低、改良Thompson分级进行性增高、髓核蛋白多糖含量进行性降低。 结论: CT引导下经皮纤维环穿刺法诱导兔椎间盘退变模型构建成功，并经影像学及病理学证实该模型退变具有持续性、渐进性。本法构建的模型具有以下优点: 1、采用微创技术构建模型，对椎间盘周围组织创伤低，实验动物成活率高。 2、其操作方法简单，定位准确，不仅可用于椎间盘退变病理生理的研究，还可应用于椎间盘注射药物新型治疗方式的领域。 3、所诱导的椎间盘退变为渐进性，可在实际工作中根据需要选择不同退变程度的椎间盘。 4、与自发性模型相比，该模型可保留正常的椎间盘作为对照组，便于观察药物治疗效果。

目录

摘要

研究背景

材料与方法

一、材料

二、方法

结果

一、影像学变化

二、大体观变化

三、病理学变化

讨论

一、模型构建的方法

二、模型退变的检测

参考文献

综述 椎间盘退变的影像学研究进展

攻读学位期间成果

致谢

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