壳聚糖/pIRES2--EGFP--hBMP2--His质粒纳米复合体构建及转染MG63细胞效率研究

摘要

背景: 在口腔医学领域，种植义齿具有传统义齿不可媲美的优点，是当前牙列缺损、缺失优选修复方案。种植义齿成功关键在于种植体早期稳定性和形成良好的骨结合。骨结合是种植体表面与骨表面间形成直接有序的结构和功能连接。因此，种植体表面处理一直是学界研究热点。以往，种植体表面处理主要集中在种植体表面物理化学处理，而基因水平的生物化学处理鲜有报道[1]。在种植体表面引入纳米尺寸的基因载体，通过载体系统内的基因激活作用，直接加强加快成骨信号的启动和转导，从而加快成骨与骨整合的研究在国内外尚属空白。 人骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)具有独特的诱导成骨活性，在修复骨质缺损方面发挥着重要的作用[2-4]。目前发现的BMP家族有21个成员，即BMP1～BMP21。在已经被克隆的7个hBMP成员基因中，hBMP2的诱导骨形成活性最强[5]。hBMP2是一种低分子量糖蛋白，属于TGF超家族成员，它作为一种具有骨诱导活性的蛋白，可以促进Ca、P在钛金属表面沉积，从而提高种植体-骨界面结合率，加快骨结合进程[6]。因此含hBMP2的表达型质粒是种植体基因活性表面设计的优选。 完成基因选择后，建立一个安全有效的载体系统也极其重要。传统基因治疗中，慢病毒载体及脂质体类载体已被广泛研究，但由于其生物安全性不确定，尚未应用于临床[7-8]。壳聚糖[9]是存在于自然界中唯一一种带阳离子、能生物降解的纳米级载体材料，其取材广泛，价格便宜，具有良好的生物相容性、可降解性和黏膜粘附性。在弱酸性溶液中，壳聚糖因分子中的葡萄糖氨基质子化而带正电荷，能够与带负电荷的质粒DNA通过静电作用凝聚成多聚复合物，从而使质粒DNA压缩成结构相对致密的纳米级颗粒，因此适合包载蛋白质、多肽、疫苗和基因等生物活性大分子，可以代替脂质体及病毒类等物质作为药物、蛋白、基因等的载体[10-12]。 因此，本研究将利用基因重组技术在体外构建人BMP2基因的真核表达重组质粒，并采用去溶剂法合成壳聚糖/质粒纳米复合体，检验其在人骨肉瘤细胞(MG63)中的转染率，为后续种植体表面生物处理奠定物质基础。 第一章:pIRES2-EGFP-hBMP2-His质粒的构建、扩增、纯化及测定 目的:构建能在真核细胞内表达EGFP和hBMP2-His基因的共表达质粒pIRES2-EGFP-hBMP2-His，完成其扩增、纯化及测定，为进一步应用该表达质粒与壳聚糖进行纳米复合体构建及转染MG63细胞提供物质基础。 方法：通过PCR方法扩增目的基因片段hBMP2-His，在引物中引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，分别回收质粒pIRES2-EGFP酶切大片段和目的基因hBMP2-His酶切产物后，将质粒pIRES2-EGFP回收大片段与目的基因片段hBMP2-His连接在一起。将连接后的产物转化入感受态菌DH5α，以摇菌法扩增质粒，用质粒提取试剂盒提取并纯化质粒，并进行质粒酶切鉴定及测序。 结果：成功构建pIRES2-EGFP-hBMP2-His质粒，并成功扩增。大量提取后获得高纯度目的质粒。BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切结果正确，测序结果正确。可供后续研究使用。 第二章:壳聚糖/pIRES2-EGFP-hBMP2-His质粒纳米复合体构建 目的:探讨弱酸性条件下5种不同分子量及脱乙酰度的壳聚糖在不同N/P比下与质粒复合后形成的纳米粒径，测定其包封率，并检测其粒径大小及表面ζ电位，从5组壳聚糖中筛选出介导转染的最佳条件。 方法：凝胶渗透色谱法测定五种壳聚糖分子量范围为17KDa～379KDa，酸碱滴定法测定其脱乙酰度范围为79％～97.37％。按不同分子量和脱乙酰度将壳聚糖分为A、B、C、D、E五组，采用去溶剂法在不同N/P比（壳聚糖中的胺基含量与质粒中磷酸基含量的摩尔比）下构建壳聚糖/pIRES2-EGFP-hBMP2-His纳米复合体，琼脂糖凝胶电泳分析不同N/P比值情况下壳聚糖对pIRES2-EGFP-hBMP2-His质粒包裹情况，荧光分光光度计测定其包封率，ζ电位仪及粒度仪检测纳米复合体表面ζ电位及粒径大小，原子力显微镜观察纳米复合体形态。 结果： 1.0.6％琼脂糖凝胶阻滞电泳实验证实了壳聚糖对pIRES2-EGFP-hBMP2-His质粒具有一定包裹作用，当N/P=1时，壳聚糖不能完全包裹基因，而N/P≥3时，壳聚糖对基因完全包裹。 2.荧光分光光度计法测定C组壳聚糖在N/P为5时，对质粒DNA平均包裹率达(96.03±0.25)％（(X)±S，n=3）。 3.合成的壳聚糖/pIRES2-EGFP-hBMP2-His纳米复合体平均粒径大小为111.7 nm～3214.2 nm、平均表面ζ电位4.93 mV～16.79 mV，粒径大小随N/P比增大呈减小趋势，纳米复合体表面ζ电位随N/P比增大而呈增大且稳定趋势，原子力显微镜镜下可观察到球形纳米复合体。 4.在纳米复合体粒径检测中发现，每组粒径分布几乎都会出现双峰，其中主峰粒径较小，数量较多;随着N/P比增大，双峰出现几率也随之增大，第二峰中大粒径复合体数量相应增多。 5.根据纳米复合体的粒径和电位检测结果显示:C组壳聚糖N/P=5时，与目的质粒复合形成的纳米复合体最适合转染，并可能取得较高的转染效率。 第三章;壳聚糖介导的pIRES2-EGFP-hBMP2-His质粒在MG63细胞内转染率分析 目的:探讨不同N/P比对于壳聚糖介导质粒基因转染MG63细胞的转染率影响。 方法：将MG63细胞复苏传代培养，分别接种于细胞培养板中，选取前期试验中C组壳聚糖（分子量77.8 KDa，脱乙酰度97.37％）为实验组，按照N/P比（壳聚糖中胺基/质粒DNA中磷酸基之比）=3，5，7，10制成壳聚糖/pIRES2-EGFP-hBMP2-His纳米复合体，并对MG63细胞进行细胞转染，48 h后上流式细胞仪检测表达绿色荧光蛋白的阳性细胞百分比，测得其转染率。同期设置脂质体阳性对照组和空白对照组。 结果： 1.在实验组不同N/P比的转染孔中，均出现转染阳性细胞，荧光倒置显微镜下能观察到表达绿色荧光蛋白的MG63细胞;但随着N/P比增加，转染率并未持续随之上升，相反，在N/P=5细胞转染孔中，其平均转染率最高，达(12.31±0.76)％（(X)±S，n=3），N/P＞5后转染率随着N/P比增大而减小。 2.在仅加入空白质粒的对照组中，转染48 h后荧光显微镜下基本观察不到绿色荧光表达细胞，流式细胞仪检测结果显示其转染率基本为0，经LSD-t检验，结果显示与实验组相比有统计学差异(P＜0.05)。 3.脂质体对照组中，其转染48 h后荧光显微镜下可观察到明显的阳性细胞，流式细胞仪检测结果显示其平均转染率为(30.36±3.32)％（(X)±S，n=3）。 结论: 通过去溶剂法，壳聚糖能够成功包裹目的基因，并将pIRES2-EGFP-hBMP2-His质粒压缩，形成适合转染MG63细胞的直径为数百纳米的微粒。N/P比是影响壳聚糖介导基因转染的重要因素，这可能和纳米复合体的胞吞及入胞后基因的释放有关。壳聚糖介导的基因转染效率显著低于脂质体，其原因是，相比脂质体通过细胞膜表面脂蛋白受体识别系统而言，壳聚糖介导的基因入胞过程需要细胞内吞作用。壳聚糖水溶性较差，需要在酸性环境下溶解，该环境对细胞生理代谢有一定影响，进而影响质粒表达。

目录

摘要

前言

第一章 pIRES2-EGFP-hBMP2-His质粒的构建、扩增、抽提、纯化及测定

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二章 壳聚糖／pIRES2-EGFP-hBMP2-His质粒纳米复合体构建

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第三章 壳聚糖介导的pIRES2-EGFP-hBMP2-His质粒在MG63细胞内转染率分析

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

总结

参考文献

附录

攻读学位期间成果

致谢

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