胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP5)调节甲基苯丙胺诱导的多巴胺能神经元的凋亡

摘要

研究背景和目的: 伴随着新型毒品的不断增多，毒品滥用已然成为全球各个国家共同面临的严峻社会问题，我国的吸毒问题也日趋严重，吸毒者为了筹集毒资，以身试法，参与的刑事犯罪案件逐年递增，毒品本身可以引起精神损害，导致暴力伤害、自杀、他杀行为增加，成瘾者劳动能力丧失，吸毒相关的猝死和戒断性死亡时有发生，不仅增加社会经济负担和社会稳定性风险，而且严重伤害人体的身体健康[1]和精神健康[2]。成为国际上共同关注的严重社会问题，也是医学届包括法医学界越来越关注的重点研究问题。 甲基苯丙胺（Methamphetamine，METH），俗称冰毒，隶属苯丙胺类兴奋剂，是化学合成的一种新型毒品。METH不但具有很强的中枢兴奋作用，吸食后可导致刻板行为、致幻、食欲减退和交感能效应等药理、毒理学特性，而且易形成药物依赖性，甚至可以一次成瘾，剂量大时可出现急性中毒甚至直接导致猝死[3，4]。对于长期使用METH者而言，其不但会引起精神行为学上的改变，还会引起中枢神经系统(CNS)的结构和功能的损伤性改变。近年来临床和动物模型研究表明，METH可通过各种途径引起额叶皮质、纹状体及海马等区域内神经细胞的坏死和凋亡[5-7]，而METH慢性使用者大脑实质内会出现与帕金森病(Parkinson'sdisease，PD)等神经退行性疾病类似的病理学改变[8-11]，这可能与METH的神经毒理作用有关，比如多巴胺(Dopamine，DA)耗竭及其受体数量减少[12，13]、氧化应激(Oxidative Stress，OS)损伤[14]、体温调节失衡导致机体高热、炎症损伤，以及细胞凋亡相关通路的激活[15]等，最终导致相关脑区和类型的神经元受损而出现退行性病变。但目前的研究结果尚不足以系统、完善的阐明METH的神经毒性机制，有待进一步深入的研究。 胰岛素样生长因子(Insulin—like Growth factor，IGF)轴是一类在分子水平调节着细胞的生长、分化和凋亡的多肽，包括IGFs(IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ)、IGF受体(IGFR)、IGF结合蛋白(IGFBP1～7)，共同构成IGF系统[16]。IGFBPs可以调节IGFs轴的活性并具有细胞和组织特异性。IGFBP5作为IGFBP5的重要成员之一，也发挥着调节细胞生长、分化及凋亡的重要作用[17]。目前许多的的研究已经证明IGFBP5在啮齿类动物的脑组织发育过程中发挥重要的作用。例如，Zhong等学者[18]在研究中发现:如果将IGFBP5的抗体添加到颗粒神经元的培养基中，则细胞的存活率显著增强;如果加入IGFBP5至培养基中则实验结果刚好相反。因此，他们认为IGFBP5的过表达很有可能诱导了颗粒神经元的早期凋亡。Marshman等人[19]研究发现在离体的小鼠乳腺上皮细胞中加入外源性的IGFBP5 or IGFBP3可以抑制IGF-Ⅰ调节细胞存活的作用，直接导致细胞的凋亡率达3倍以上。随后，Butt等人[20]发现IGFBP5可以激活MDA-MB-231乳腺癌细胞的中的caspase-8和caspase-9，进而通过凋亡通路中的BCL-2机制诱导细胞凋亡。这些发现都与IGFBP5可以诱导细胞凋亡这一效应是一致的。 本课题组多年来致力于METH的神经毒性研究，我们在前一阶段的研究中发现，对METH注射后的大鼠纹状体等部位检测发现多巴胺能神经元的凋亡增加，PC12细胞（多巴胺能神经元细胞株）用METH处理后得到相对应的结果，并且发现METH处理后的PC12细胞在24小时内IGFBP5显著升高，但IGFBP5是否参与调节METH诱导的多巴胺能神经元凋亡，如果参与，其作用机制为何等一系列问题并未得到确切答案。于是，本文立足以上研究基础，拟解决IGFBP5是否参与调节METH诱导的PC12细胞凋亡及调节机制等问题，为METH成瘾者的治疗提供新的思路和有效的药物作用靶点。 研究内容及方法: 一.IGFBP5在METH处理的大鼠脑组织标本和PC12细胞株中的表达情况 1.采用全基因组芯片技术检测大鼠所有基因在METH毒性损伤的PC12细胞中的表达，初步确定所有基因的表达水平的变化，以期筛选出差异表达的mRNA。 2.采用Real Time PCR（荧光定量PCR）手段验证基因芯片中检测出的IGFBP4、IGFBP5、IGFBP7 mRNA水平的表达。用METH对PC12细胞进行处理，检测基因芯片中信号增强的IGFBP4、IGFBP5、IGFBP7 mRNA的特异性表达情况。 3.建立急性METH中毒大鼠模型，选取大鼠纹状体，采用荧光定量PCR手段验证IGFBP4、IGFBP5、IGFBP7 mRNA在大鼠组织标本中的特异性表达情况。 4.采用荧光定量PCR手段检测不同浓度METH处理PC12细胞相同时间以及同一浓度METH处理PC12细胞不同时间的情况下IGFBP5 mRNA表达情况。同时采用Westen Blot方法IGFBP5蛋白表达情况，确定METH浓度和处理时间对IGFBP5的影响。 二.IGFBP5基因沉默的PC12细胞在METH诱导下IGFBP5的表达及细胞的凋亡情况 1.针对IGFBP5基因设计并合成三条siRNA干扰序列，采用RNA干扰技术（RNAi）处理PC12细胞，采用荧光定量PCR方法检测出有效干扰序列。 2.采用有效干扰序列沉默PC12细胞的IGFBP5 mRNA表达后，用METH进行处理，采用Westen Blot方法IGFBP5蛋白表达情况，确定IGFBP5的表达上升在METH的毒性损伤过程中是否为伴随现象。 3.采用TUNEL法检测IGFBP5基因沉默的PC12细胞经METH处理后的细胞凋亡情况。 三.初步探测IGFBP5在调节METH诱导的细胞凋亡作用中的分子机制 1.采用Westen Blot方法检测IGFBP5基因沉默的PC12细胞经METH处理后s细胞色素C分布情况及caspase3、PARP蛋白的表达情况。 四.统计学方法 采用统计软件SPSS13.0对实验结果进行统计学处理和分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示。实验组和对照组刻板行为评分及基因表达量比较采用两独立样本T检验;本文中其他基因、蛋白表达量的分析采用单因素方差分析(One-way ANOVA)比较各组差异，如方差齐性，多重比较采用LSD法，如方差不齐，采用Welch值，多重比较采用Dunnett T3法。P＜0.05被认为有统计学差异。 结果: 一.IGFBP5在METH处理的大鼠脑组织标本和PC12细胞株中的表达情况 1.采用基因芯片检测手段检测IGFBPs在METH毒性损伤的PC12细胞中的表达情况。结果显示:IGF结合蛋白中的IGFBP4、IGFBP5及IGFBP7 mRNA表达升高，IGFBP1、IGFBP2、IGFBP3及IGFBP6 mRNA表达不升高或不表达。 2.采用荧光定量PCR手段验证METH处理的PC12细胞中的IGFBP4、IGFBP5、IGFBP7 mRNA水平的特异性表达情况。结果显示，METH处理的PC12细胞中只有IGFBP5 mRNA表达显著升高，IGFBP4以及IGFBP7 mRNA表达未见升高。 3.建立急性METH中毒大鼠模型，选取大鼠纹状体，采用荧光定量PCR手段验证IGFBP4、IGFBP5、IGFBP7 mRNA在大鼠组织标本中的特异性表达情况。结果显示，实验组大鼠纹状体组织中只有IGFBP5 mRNA表达显著升高，IGFBP4以及IGFBP7 mRNA表达未见升高。 4.采用荧光定量PCR手段检测不同浓度METH处理PC12细胞相同时间以及同一浓度METH处理PC12细胞不同时间的情况下IGFBP5 mRNA表达情况。结果显示，IGFBP5 mRNA表达量与METH的处理浓度呈浓度依赖特性，与METH的处理时间呈时间依赖特性。同时采用Westen Blot方法IGFBP5蛋白表达情况，确定METH浓度和处理时间对IGFBP5的影响。结果显示，IGFBP5蛋白表达量与与METH的处理浓度呈浓度依赖特性，与METH的处理时间呈时间依赖特性。并且，IGFBP5 mRNA和蛋白表达量的上调在时间上符合。 二.IGFBP5基因沉默的PC12细胞在METH诱导下IGFBP5的表达及细胞的凋亡情况 1.针对IGFBP5基因设计并合成三条siRNA干扰序列，采用RNA干扰技术(RNAi)处理PC12细胞，采用荧光定量PCR方法检测出有效干扰序列。结果证实其中两条siRNA序列能够沉默IGFBP5基因。 2.采用有效干扰序列沉默PC12细胞的IGFBP5基因表达后，用METH进行处理，采用Westen Blot方法IGFBP5蛋白表达情况，确定IGFBP5的表达上升在METH的毒性损伤过程中是否为伴随现象。结果显示，IGFBP5基因沉默的PC12细胞与未沉默的细胞相比较，在METH的诱导下，其蛋白表达显著下调。该结果证实IGFBP5在METH的毒性损伤过程中并不是伴随现象，其参与调节METH的毒性损伤过程。 3.采用TUNEL法检测IGFBP5基因沉默的PC12细胞经METH处理后的细胞凋亡情况。结果显示，IGFBP5基因沉默的PC12细胞与未沉默的细胞相比较，在METH的诱导下，其细胞凋亡率显著下调。该结果再次证实IGFBP5在METH的毒性损伤过程中并不是伴随现象，并且从反面说明IGFBP5在METH诱导的细胞凋亡作用中起促进作用。 三.初步探测IGFBP5在调节METH诱导的细胞凋亡作用中的分子机制 1.采用Westen Blot方法检测IGFBP5基因沉默的PC12细胞经METH处理后细胞色素C分布情况及caspase3、PARP蛋白的表达情况。结果显示，IGFBP5基因沉默的PC12细胞与未沉默的细胞相比较，在METH的诱导下，细胞色素C由线粒体内释放至细胞质内，caspase3蛋白表达显著下调，未活化型PARP及活化型PARP蛋白表达均显著下调。初步探明证实IGFBP5通过调节细胞色素C的释放及caspase3、PARP的活性调节神经元凋亡，其作用机制可能与线粒体凋亡途径有关。 结论 1.IGFBP5在METH处理的大鼠纹状体组织和PC12细胞株中均表达上调，说明IGFBP5确实参与了METH诱导的多巴胺能神经元凋亡过程。 2.PC12细胞经IGFBP5基因沉默处理后能降低METH诱导的细胞的凋亡，为IGFBP5参与METH诱导的细胞凋亡过程提供深层证据，并且证明IGFBP5的上调并非为凋亡过程的伴随现象，而是对METH诱导的多巴胺能神经元凋亡具有重要的调节作用。 3.IGFBP5基因沉默的PC12细胞与未沉默的细胞相比较，在METH的诱导下，细胞色素C由线粒体内释放至细胞质内，caspase3蛋白表达显著下调，未活化型PARP及活化型PARP蛋白表达均显著下调。初步探明IGFBP5通过激活线粒体凋亡途径，调节细胞色素C的释放及caspase3、PARP的活性而调节神经元凋亡。 本研究创新之处 1.第一次提出IGFBP5参与了METH的神经损伤过程。 2.第一次提出IGFBP5调节了METH诱导的多巴胺能神经元细胞的凋亡。 3.第一次证明证实IGFBP5通过调节细胞色素C的释放及caspase3、PARP的活性调节神经元凋亡，其作用机制可能与线粒体凋亡途径有关。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 IGFBP5在METH处理的大鼠脑组织标本和PC12细胞株中表达情况

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第二章 IGFBP5基因沉默的PC12细胞在METH诱导下IGFBP5的表达及细胞凋亡情况

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第三章 初步探测IGFBP5在调节METH诱导的细胞凋亡作用中的分子机制

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

全文小结

中英文缩略词表

致谢

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