TRPC1、TRPC6和TRPV4在缺氧肺高压发病及其主要病理生理学改变中的作用

摘要

背景和目的: 居住在高海拔地区或一些肺部疾病，如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺纤维化、呼吸睡眠暂停综合症等所引起的慢性缺氧会导致肺高压。缺氧肺高压(CHPH)主要的病理生理学改变包括:血管张力的增高、对血管活性物质反应性的改变以及血管重塑的发生，最终导致右心室重塑，右心衰竭，甚至死亡。缺氧肺高压的发病机制十分复杂，经过几十年的研究，人们逐渐认识到肺动脉平滑肌细胞内离子平衡，尤其是钙离子代谢的变化是调控缺氧肺高压各种病理生理学改变发生的重要因素。大量的研究表明，细胞外钙离子内流及细胞内钙库，如内质网、线粒体的钙释放是调控细胞内钙离子浓度的两大核心环节，而二者既相互独立又相互影响。目前，已经有足够的证据显示，急性缺氧及慢性缺氧所致的HPV及CHPH均与这些膜通道密切相关。 瞬时受体电位(TRP)是成百上千种膜通道中的一类。TRP基因编码了一个非选择性阳离子通道家族，共含28个成员，它们在血管平滑肌上执行各种不同的功能。我们前期的研究探查了肺动脉平滑肌细胞TRPC、TRPM及TRPV3个TRP通道亚家族，发现TRPC1、TRPC6、TPRM8和TRPV4是各自家族中表达量最高的亚型并且具有各自的功能。这也为后续有针对性的研究缺氧肺高压和TRP奠定了基础。 在之前的研究中我们首次提出，在缺氧大鼠肺动脉平滑肌上，TRPC1和TRPC6表达显著上调，同时TRPC1介导的SOCE和TRPC6介导的ROCE均显著增强，并证实这些改变与缺氧肺动脉平滑肌细胞增高的基础张力和胞内钙浓度密切相关。后续的研究发现缺氧诱导因子-1α是调控这一现象重要的转录因子。事实上，这种TRPCs表达异常在特发性肺动脉高压病人及秋水仙碱肺动脉高压大鼠模型的肺动脉平滑肌上也有报道，并且这些异常表达的TRPCs与增大的SOCE和对内皮素-1（ET-1）的反应性相关。此外，抑制TRPC1和TRPC6可以显著抑制肺动脉平滑肌的增殖。西地那非及丹参酮可以通过阻断这种TRPCs的异常表达来治疗缺氧肺高压。综上所述，TRPC1和TRPC6与缺氧肺高压息息相关，但是这些TRPCs表达和功能的异常对CHPH的发病是否不可缺少仍不得而知。 另一方面，TRPV4作为一种机械敏感的非选择性阳离子通道，在血管内皮细胞及平滑肌细胞上均有高表达。大量研究数据显示，TRPV4可以调节多种血管功能，如血管收缩、血管内皮屏障、SOCE和ROCE。在肺动脉平滑肌上，TRPV4可以被低渗溶液或机械刺激所激活，引起钙离子和钠离子以10∶1的比例内流。TRPV4是TRPV家族中唯一受缺氧调控的亚型，缺氧条件下其表达和功能的增强参与调控血管的基础张力及肌源性张力。敲除trpv4基因，可以显著抑制缺氧肺高压的发生，缓解缺氧肺血管重塑。然而，TRPV4对CHPH另一重要病理生理学改变—血管收缩活性的影响尚无报道。前期研究显示，在肺动脉平滑肌细胞上五羟色胺（5-HT）可以诱发一种花生四烯酸依赖的非选择性阳离子电流，该电流的药理学特性与TRPV4电流十分类似。另外，激活血管内皮细胞TRPV4可以促进血管舒张，这与其在肺动脉平滑肌细胞上介导血管收缩的作用截然相反。故而，研究TRPV4与血管收缩性，尤其是缺氧条件下TRPV4是否参与及如何参与调控血管收缩反应性是一个十分有趣的科学问题。 材料和方法: 1、TRPC1(Trpc1-/-)、TRPC6(Trpc6-/-)、TRPC1/TRPC6(Trpc1-/-Trpc6-/-)和TRPV4(Trpv4-/-)系统敲除小鼠为研究对象。随机选取8-12周龄不同基因型及年龄匹配的野生型(WT)小鼠在缺氧条件下(10％O2)饲养3-4周制造CHPH模型。 2、运用Real-time PCR和Western Blot来检测常氧及缺氧小鼠肺动脉平滑肌TRPCs转录水平和蛋白水平的表达。 3、采用开胸，右心室置入压力换能器，左心室置入P-V换能器，升主动脉超声血流测量的方法，测定小鼠右心室收缩压(RVSP)、平均肺动脉压(MPAP)和心输出量(CO)。肺循环阻力(PVR)由MPAP及CO算出，公式为:(MPAP-P左房)/CO（设定P左房舒张末压为0）。右心室占左心室及室间隔重量的百分比(RV/LV+S)反应右心重塑的程度。 4、使用wire-myograph来测量血管张力及血管对5-HT、ET-1和苯肾上腺素(Phenylephrine，PE)的收缩反应。 5、将琼脂糖灌注，石蜡包埋的肺组织切片，通过免疫组化染出平滑肌α-actin蛋白来识别和评估肺阻力血管（＜100μm)的肌化程度。 6、使用钙荧光染料fluo3-AM来检测分离培养的小鼠肺动脉平滑肌细胞的胞内钙浓度并在pClamp软件中实时记录。 7、统计学处理:所有数据均以均数±标准误(mean±SE)表示，应用SigmaPlot或Grph Pad软件进行统计学处理。样本均数采用t检验。满足方差齐性要求时，多组样本均数采用One-Way ANOVA，多重比较采用Bonferroni法;不满足方差齐性要求时，多组样本均数采用Welch法，多重比较采用Dunnett's T3法。 结果: 1、TRPC家族在Trpc1-/-、Trpc6-/-WT小鼠肺动脉平滑肌上的表达。常氧条件下，除敲除基因外，TRPC1-7亚型在Trpc1-/-, Trpc6-/-和WT小鼠肺动脉平滑肌上有类似的mRNA表达特性:TRPC1表达量最高，TRPC6和TRPC3次之，而TRPC4，5和7表达量较低。3周缺氧会显著上调WT肺动脉平滑肌上TRPC1(246±51％，n=6，p＜0.01)和TRPC6(103±38％，n=6，p＜0.0S)蛋白水平的表达，这种异常表达不受基因敲除的影响。 2、敲除trpc1和trpc6基因抑制缺氧肺高压的发生。 在常氧条件下，Trpc1-/-、Trpc6-/-和WT小鼠RVSP、MPAP和RV/(LV+S)无任何差异。缺氧1周显著增高WT小鼠的上述血流动力学指标，并且随着缺氧时间延长，肺高压逐步加重。与WT小鼠相比，Trpc1-/-小鼠在缺氧1周及3周的肺高压程度均较轻。但是，Trpc6-/-小鼠仅在缺氧1周时肺高压显著缓解;当缺氧达3周后，其肺高压的严重程度和WT小鼠仅存在可疑性差异(MPAP，WT:18.2±0.4mm Hg;Trpc6-/-:17.1±0.4mmHg，p=0.056)。进一步研究发现，Trpc1-/-Trpc6-/-小鼠在常氧条件下即出现肺循环低阻，3周缺氧后，其肺高压的严重程度显著低于WT及任一单一敲除小鼠(MPAP，WT:18.2±0.4，n=33; Trpc1-/-Trpc6-/-:14.6±0.4，n=9，p＜0.001)。 3、TRPC1和TRPC6参与缺氧诱导的肺血管重塑。 我们通过分析肺阻力血管肌化程度和血管密度来评价血管重塑的程度。在基础水平，肺阻力血管肌化程度在各基因型小鼠中一致。缺氧3周后，WT小鼠出现明显肺血管重塑，表现为无肌化肺血管比例的下降伴随肌化血管比例的升高（无肌化血管:常氧组=80.8±3.3％，缺氧组=58.0±6.9％，P＜0.001;部分肌化血管:常氧组=14.9±3.0％，缺氧组=30.1±5.2％，P＜0.01;完全肌化血管:常氧组=4.3±0.9％，缺氧组=11.9±2.2％，P＜0.01)。这种重塑在Trpc1-/-和Trpc6-/-小鼠中显著减轻，仅完全肌化肺血管的比例较常氧组有所升高。而在Trpc1-/-Trpc6-/-小鼠中，这种肌化重塑完全消失（部分肌化血管，常氧组:8.1±1.9％，缺氧组:11.6±1.2％，P=0.174;完全肌化血管，常氧组:8.9±2.0％，缺氧组:11.5±0.3％，P=0.252)。同时，缺氧造成WT小鼠血管密度下降并且这种改变在各种基因型小鼠中普遍存在。 4、TRPC1和TRPC6共同参与调控血管张力，但二者功能有所不同。 在本课题的研究中，我们首次采用wire-myograph来测定小鼠肺动脉的血管张力。我们通过在1.5mM Ca2+、0mM Ca2+和0mM Ca2+血管舒张剂3种不同条件下测定的牵拉-张力曲线，来计算肺血管环的主动张力。结果显示:常氧条件下小鼠肺动脉有一个较小的张力，缺氧后该血管张力明显增大。敲除trpc1基因对肺动脉常氧下的基础张力无影响，但显著抑制了缺氧诱导的血管张力(p＜0.01)。相反，敲除trpc6基因显著降低了肺动脉常氧下的基础张力(p＜0.01)，但在缺氧后其血管张力仍出现增高。 5、TRPC1和TRPC6参与调控缺氧肺动脉的血管收缩活性。 常氧条件下，Trpc1-/-、Trpc6-/-和WT小鼠肺动脉对五羟色胺（5-HT）收缩活性无显著性差异。缺氧后，WT肺动脉对5-HT的最大反应增高，增高的部分在Trpc1-/-小鼠部分抑制(WT:146.8±4.4％，n=12; Trpc1-/-:130.6±2.8％，n=12，p＜0.01)，但在Trpc6小鼠完全阻断(常氧组:110.9±1.0，n=17;缺氧组:112.9±2.0％,n=12,P=0.594)。 6、肺血管环实验中，TRPV4选择性抑制剂最适浓度的选择。 HC-067047和RN-1734是目前常用的TRPV4选择性抑制剂，文献中常用浓度为5μM和30μM。5μM的HC-067047在WT肺动脉上显著抑制苯肾上腺素(PE)引起的收缩反应。然而，Trpv4-/-肺动脉对PE的反应性和WT无任何差异。5μMHC-067047和30μM RN-1734均抑制Trpv4-/-肺动脉对PE的反应性。进一步实验发现，仅0.5μM HC-067047对高K+引起的动脉收缩无明显抑制作用。 7、TRPV4对5-HT收缩反应的影响。 使用0.5μM HC-067047或敲除trpv4基因对PE和内皮素-1（ET-1）的收缩反应无任何作用，但是显著降低去除内皮的肺动脉对5-HT的反应敏感性(对照组:7.8±0.06,n=5;HC-067047:7.5±0.09,n=5,p＜0.05)。 8、TRPV4参与5-HT引起的肺动脉平滑肌细胞钙浓度改变。 5-HT刺激肺动脉平滑肌细胞，可以诱发细胞钙离子浓度变化，表现为一个瞬时的峰伴随一个平台期。0.5μM HC-067047不能抑制Trpv4-/-的肺动脉平滑肌细胞对5-HT的反应(p＜0.001)，但却能显著抑制WT平滑肌细胞钙反应的瞬时峰及平台期。其抑制效应与1μM电压门控钙通道抑制剂硝苯地平类似，且二者联合使用产生的效应和单用0.5μM HC-067047相似。在无钙环境下，5-HT仅能诱发一个非常小的钙反应。与之对应，Xestospongin C在有钙环境下也只能抑制一小部分的瞬时峰。 9、阻断TRPV4可以缓解缺氧肺高压的发病。 缺氧3周后，CHPH发生:RVSP、MPAP、PVR和RV/(LV+S)显著升高，但这些血流动力学指标上升的程度在Trpv4-/-小鼠中显著减轻(p＜0.001)。 10、TRPV4对缺氧诱导的血管收缩性的影响。 慢性缺氧显著提高了内皮完整(EC+)及内皮去除（EC-）肺动脉对5-HT的反应性。0.5μM HC-067047可以抑制EC+和EC-肺动脉对5-HT的Emax且这种抑制性在EC-肺动脉中更强。在Trpv4-/-小鼠中，5-HT的反应性也有所提高，但其Emax增大的比例显著低于WT小鼠(EC+: WT=34.8±6.4％，Trpv4-/-=17.4±2.7％ P＜0.01; EC-: WT=54.3±3.8％,Trpv4-/-34.4±3.8,P＜0.001)。 结论: 1、TRPC1影响缺氧肺高压发病的

目录

摘要

前言

第一章 TRPC在小鼠肺动脉平滑肌的表达及慢性缺氧对其的影响

1．1 前言

1．2 材料与方法

1．2．1 实验动物

1．2．2 主要试剂

1．2．3 主要仪器及设备

1．2．4 实验方法

1．2．5 统计学处理

1．3 结果

1．3．1 WT，Trpc1-／-及Trpc6-／-小鼠肺动脉平滑肌TRPCs mRNA的表达

1．3．2 慢性缺氧对小鼠肺动脉平滑肌TRPC1和TRPC6蛋白表达的影响

1．4 讨论

第二章 TRPC1和TRPC6对缺氧肺动脉高压发病的影响

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验动物

2．2．2 主要试剂及设备

2．2．3 实验方法

2．2．4 统计学处理

2．3 结果

2．3．1 敲除trpc1／trpc6基因部分抑制缺氧肺高压

2．3．2 trpc1／trpc6基因双重敲除进一步缓解缺氧肺高压的发生

2．4 讨论

第三章 TRPC1和TRPC6参与调控缺氧肺高压主要的病理生理学改变

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验动物

3．2．2 主要试剂

3．2．3 主要设备

3．2．4 实验方法

3．2．5 统计学处理

3．3 结果

3．3．1 TRPC1和TRPC6参与调控缺氧致肺血管重塑

3．3．2 TRPC1和TRPC6对肺动脉张力的影响

3．3．3 TRPC1和TRPC6常氧及缺氧条件下对5-HT介导收缩的作用

3．4 讨论

第四章 TRPV4在肺动脉收缩活性中的作用

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验动物

4．2．2 主要试剂

4．2．3 主要设备

4．2．4 实验方法

4．2．5 统计学处理

4．3 结果

4．3．1 选择性TRPV4抑制剂在血管张力实验中的最适浓度

4．3．2 TRPV4对5-HT、ET-1以及PE引起的血管收缩的影响

4．3．3 TRPV4在肺动脉平滑肌上参与5-HT介导的胞内钙离子浓度改变

4．3．4 敲除trpv4基因缓解缺氧肺高压的发生

4．3．5 慢性缺氧环境下TRPV4对5-HT介导的血管收缩的影响

4．4 讨论

全文小结

参考文献

攻读学位期间的成果

致谢

声明

统计学证明