COPD患者诱导痰T细胞巨噬细胞移动抑制因子的表达研究

摘要

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease COPD)是一种常见的以持续气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病，其主要症状是慢性、进行性加重的呼吸困难、咳嗽、咳痰。然而，COPD并不仅仅是一种简单的“吸烟者的咳嗽”，而是一种诊断不足的，伴有生命危险的肺部疾病，进一步发展则会导致死亡。COPD患病率及死亡率均高，已成为一个重要的公共卫生问题，目前COPD居全球死亡原因的第四位，随着吸烟、空气污染以及老龄化的加重，COPD的流行和负担将会逐年加重，世界卫生组织评估在2030年COPD将上升成为全球死亡原因第三位的疾病。当前用于COPD治疗的药物，只能够延缓COPD患者肺功能的下降，而不能够完全改善患者的症状及生活质量，目前还需要更多的研究来完善COPD的发病机制以期发现更有效的治疗方式。 COPD的主要症状与其病理生理特征密切相关，目前多数的研究认为，COPD的特点是以气道、肺实质和肺血管的慢性炎症，其中炎症细胞的激活、趋化及炎症因子的释放是COPD气道炎症的中心环节，此外，自主神经功能紊乱（如胆碱能神经受体分布）、肺部蛋白酶和抗蛋白酶系统失衡、氧化应激等亦参与了COPD的发病，实际上，炎症和其他的发病机制息息相关，互为因果。首先暴露于香烟，氮氧化合物以及有毒气体等COPD的危险因素之中均可活化气道内的细胞，继而产生大量强有力的细胞因子、趋化因子，吸引炎细胞募集到肺部，而炎细胞又进一步分泌各种炎症因子，从而形成环路，扩大了炎症反应，同时炎症细胞发挥作用的同时又释放了一些对肺组织产生破坏的因子，包括各种弹性蛋白酶，氧化应激的产物等导致肺实质的破坏，肺气肿的形成。可见慢性炎症是COPD形成的基础。 COPD的慢性炎症反应中，由于参与的炎症细胞及炎症因子较多，还未有一种细胞因子抑制剂能够改善COPD的炎症进程，因此找到炎症反应的枢纽环节则至关重要。巨噬细胞移动抑制因子（microphage migration inhibitory factor，MIF）被报道是调节宿主免疫及免疫应答的关键细胞因子，主要由T细胞分泌，而几乎体内所有炎症细胞均有MIF的表达，他稳定存在于与外界直接接触的组织细胞之中，包括肺、皮肤的上皮层以及泌尿胃肠道，其分泌的调节受到了抗原刺激及垂体-下丘脑-肾上腺轴的共同调控[1]，MIF的生物学功能包括抑制巨噬细胞的移动、调节T细胞的生长和活化，它直接促进其他多种炎症因子的分泌，如TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-8、IL-17、花生四烯酸及多种蛋白酶的产生，间接通过上调NF-κB的表达来进一步促进炎症因子的产生[2]等。并且他是体内唯一能对抗糖皮质激素的免疫抑制作用和抗炎活性的细胞因子，这些研究均表明MIF是体内免疫系统不可或缺的一种细胞因子，与糖皮质激素共同调节机体免疫。此外，MIF还可通过抑制P53基因所引起的细胞凋亡作用来介导细胞的增殖和凋亡[3]，因此也对维持炎症细胞的活性和肿瘤细胞的增殖有重要意义，为炎症的发生和肿瘤生长建立起了桥梁。 MIF在多种疾病的发生发展中占有重要的地位，如肾小球肾炎、急性呼吸窘迫综合征、炎症性肠病、动脉粥样硬化等，与COPD的研究较少。国内外中仅有佘惟槟[47]等通过检测吸烟患或未患慢性阻塞性肺疾病患者肺组织中MIF的表达水平，结果显示MIF在肺部广泛表达，吸烟患COPD者较吸烟未患COPD者肺组织MIF蛋白及mRNA的表达增多，与FEV1％及FEV1/FVC％呈负相关，提示MIF可能参与COPD的炎症反应，我们先前的研究通过检测外周血T细胞及血清中MIF的表达水平来探讨MIF与COPD的关系，结果表明急性加重组外周血中T细胞MIF的表达明显增高，而稳定期与对照组则无明显差异，血清中MIF的表达三组无差异[48]。我们推测MIF作为一种细胞因子可能对病变的部位直接产生的作用更为明显，因此肺内及气道内的表达对于探讨MIF在COPD发病中的作用显得十分必要，同时，由于T细胞是MIF的主要来源，因此，我们通过检测诱导痰中炎症细胞以及T细胞中MIF的表达，旨在探讨气道中炎症细胞以及MIF在COPD发病中的可能作用。 研究目的:了解诱导痰炎细胞在COPD急性加重期、稳定期的变化，探讨炎症细胞百分比的变化与各临床指标的相关性;测定COPD患者在急性加重期、稳定期以及对照组诱导痰中T细胞MIF的表达及其与各临床指标的相关性分析。 研究方法:研究对象分为三组:COPD急性加重组，COPD稳定组及对照组。COPD患者均符合2011年GOLD制定的诊断标准，COPD急性加重组为2013年1月至2013年11月我院呼吸内科住院治疗的患者，既往诊断为COPD，近期因呼吸道症状加重，超过了日常变异范围，需要调整药物而来我院治疗;COPD稳定期组为同期我院门诊初诊的COPD患者，既往未使用过激素类制剂，两个月内未有急性发作;对照组为同期来我院体检的人员，选择年龄及吸烟史匹配，经胸片、肺通气功能测定均未发现异常的人员。排除标准:已知MIF可能参与发病的疾病:如糖尿病，冠心病，心肌梗死，风湿免疫性疾病（类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、血管炎），消化道疾（肝炎、肝硬化、炎症性肠病），泌尿系疾病（急慢性肾小球肾炎、肾病综合症），恶性肿瘤等;可能影响实验结果的肺部疾患:如肺结核，肺癌，支气管哮喘、过敏性鼻炎，支气管扩张以及呼吸道感染及传染病患者等，以及排除不适合进行诱导痰及肺功能检查的患者。细胞计数法检测正常吸烟对照组、COPD稳定组及COPD急性加重组诱导痰中各炎症细胞百分比，流式细胞术检测CD4+MIF+T细胞占总CD4+T细胞的百分比(CD4+MIF+T％)，CD8+MIF+T细胞占总CD8+T细胞的百分比(CD8+MIF+T％)，MIF的平均荧光强度(MFI)，并与FEV1％、FEV1/FVC％、CAT评分、mMRC呼吸困难等级等行相关性分析。 统计学分析应用SPSS21.0软件，连续型变量数据以均数±标准差（(x)±S）表示，数据均先进行正态性检验和方差齐性检验，三组比较时采用单因素方差分析(ANOVA)、两两比较方差齐则采用LSD方法方差不齐采用Tambance's T2，相关性分析中若两组资料均服从正态分布则采用pearson相关检验，若两者有一方不服从正态分布则使用spearman相关检验;CAT评分用两独立样本比较的t检验，mMRC等级使用多个样本比较的Kruskal-Wallis H检验。除正态性检验及方差齐性检验P＞0.1表示数据符合正态分布并且方差齐，其余则以P＜0.05为差异有统计学意义。 结果: 1.一般资料:急性加重期组20例，其中男19例，女1例，平均年龄（68.8±8.1）岁，FEV1％ pred55.8±11.2，FEV1/FVC58.5±7.1，吸烟指数（包年）:130.22±234.94，体重指数:20.8±2.6; CAT评分:19.8±7.4，mMRC平均秩:35.8;稳定期组18例，其中男性16例，女性2例，平均年龄为（65.2±6.2）岁，FEV1％pred60.6±17.5，FEV1/FVC61.1±5.6，吸烟指数（包年）:96.88±183.40，体重指数:21.7±2.6;CAT评分:18.6±8.1，mMRC平均秩:32.6;对照组15例，其中男13例，女2例;平均年龄（63.5±4.8）岁，FEV1％ pred89.3±5.5，FEV1/FVC85.9±5.1，吸烟指数（包年）:25.80±15.91，体重指数:22.5±3.2; mMRC平均秩:8.5。 2.中性粒细胞百分比在三组中有统计学差异（F=23.56，P＜0.05），其中急性加重组明显高于稳定组及对照组，稳定组与对照组无统计学差异;三组中巨噬细胞百分比有统计学差异(F=28.92，P＜0.05)，两两比较中，在急性加重组低于稳定组及对照组，稳定组和对照组无统计学差异;淋巴细胞百分比在三组比较中亦有统计学差异(F=7.04，P＜0.05)，两两比较中，急性加重组与稳定组相比无统计学差异，但均较对照组升高;嗜酸性粒细胞百分比各组间无统计学差异（F=7.040.595，P＞0.05）。中性粒细胞百分比与FEV1％及FEV1/FVC呈负相关(r分别为-0.461、-0.400，P均小于O.05)，其余细胞百分比与患者症状及疾病相关指数均无相关性。 3.MIF在CD8+T细胞中的表达:CD8+MIF+T细胞占CD8+T细胞的百分比:急性加重组较稳定期升高，稳定期较对照组升高，差异均具有统计学差异;CD8+MIF的平均荧光强度:急性加重期组相对于稳定期组、对照组均有明显升高，差异有统计学意义，稳定期组相对于对照组并没有获得统计学差异。MIF在CD4+T细胞中的表达:CD4+MIF+T细胞占CD4+T细胞的百分比:急性加重期组相对于稳定期组、对照组均有明显升高，差异有统计学意义，稳定期组相对于对照组并没有获得统计学差异;CD4+MIF的平均荧光强度各组相比均未见差异。CD8+MIF+T％与FEV1％呈负相关(r=-0.439，P＜0.05)，与FEV1/FVC％呈负相关(r=-0.137，P＜0.05)，与mMRC呼吸困难指数呈正相关（r=0.466，P＜0.05），与CAT评分呈正相关（r=0.491，P＜0.05）;CD4+MIF+T％亦与mMRC呼吸困难指数级CAT评分呈正相关，（r分别为0.450、0.415，P值均小于0.05）。 4.急性加重期CRP与CD8+MIF+T％、CD4+MIF+T％、CD8+MIF MFI及CD4+MIF MFI的相关性分析: CRP与各值均呈正相关，r值分别为:0.613，0.541，0.614，0.486 P值均小于0.05。 结论: 1.COPD患者诱导痰中炎症细胞的比例在急性加重期与稳定期时不尽相同，急性加重期时以中性粒细胞为主，稳定期则以中性粒细胞和巨噬细胞为主，淋巴细胞的百分比的改变则可能示区别正常吸烟者和COPD患者的标准之一，嗜酸性粒细胞在COPD发病中的意义可能不大。 2.MIF可能参与了COPD稳定期及急性加重期的发病，尤其是急性加重期;同时在稳定期，MIF可能主要是通过CD8+T细胞发挥相应的作用。

目录

摘要

前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

1．3 研究内容

材料和方法

2．1 所用仪器和设备

2．2 实验所需药品及其配置

2．3 临床资料

2．4 研究方法

结果

3．1 患者的一般资料

3．2 诱导痰炎性细胞

3．3 诱导痰巨噬细胞移动因子

讨论

4．1 COPD患者诱导痰炎性细胞的变化及其意义

4．2 COPD患者诱导痰T细胞中MIF的表达及其意义

4．3 不足与展望

全文结论

参考文献

英文缩略词表

成果

致谢

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