G--CSF动员后外周血T细胞受体谱系以及γδ T细胞功能亚群变化的研究

摘要

研究背景及目的： 异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)是治疗血液系统肿瘤与非血液系统肿瘤和再生障碍性贫血等疾病的主要手段，甚至被认为是治愈某些肿瘤的唯一方法。移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)是allo-HSCT后的主要合并症，也是当前制约allo-HSCT疗效的最主要因素之一。重组人粒细胞集落刺激因子(recombinanthuman granulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF)动员的外周血干细胞已逐渐成为造血干细胞的一种主要来源，现广泛用于恶性和非恶性血液疾病的allo-HSCT中。与骨髓移植相比，虽然输入10倍以上的成熟T淋巴细胞，但是GVHD特别是急性GVHD的发病率和严重程度并未明显增加。临床和实验数据表明G-CSF通过影响T细胞的免疫调节效应来降低GVHD的发生率，其机理包括:①直接作用于T细胞，如直接调节T细胞上G-CSF受体，诱导1型辅助性T淋巴细胞向2型辅助性T淋巴细胞极化，促进调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)分化等;②通过效应细胞间接作用于T细胞，如诱导耐受性树突状细胞分化以及改变细胞因子的分泌等。然而，上述机制并不能完全解释G-CSF诱导免疫耐受的全部机制。 T细胞的增殖和功能活化主要是通过其表面的T细胞受体/CD3复合物(Tcell receptor/CD3 complex，TCR/CD3)而启动。TCR是T细胞表面识别抗原和介导免疫应答的分子，包括α、β、γ和δ四种肽链，以由二硫键连接的异二聚体(α/β)或（γ/δ）形式存在。T细胞根据其表面TCR的不同，分为αβ+T细胞和γδ+T细胞两群。αβ+T细胞占外周血T细胞的90％-95％，主要参与获得性免疫过程，通过主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)限制性识别细胞。根据是否表达CD4或CD8共同受体分子，成熟的αβ+T细胞细胞可划分为CD4和CD8两个主要亚群。γδ+T细胞被认为是介于获得性与天然免疫之间的特殊免疫细胞类型，仅占外周血CD3+T细胞的1％-10％，大部分γδ+T细胞不表达CD4、CD8分子，具有特异性识别抗原功能而不受MHC限制，在机体抗感染、抗肿瘤和免疫监视等方面发挥重要作用。由于TCR链缺少一个胞内延长区，TCR需通过CD3分子将活化信号传导至细胞内，导致胞质信号机制的活化，进而调节后续的细胞反应。CD3分子包含:CD3γ、δ、ε、ζ和η（ζ和η为同源异构体）多个亚单位，通常以γε和δε异二聚体及ζζ同二聚体的形式存在，其中CD3ζ链对于跨膜信号传递尤为重要。 介导GVHD的免疫反应可能是由某一或某些克隆性T细胞增殖所引起。既往研究发现αβ+T细胞是引起GVHD的主要效应细胞;一些GVHD患者外周血T细胞谱系出现倾斜分布，且部分TCRVβ亚家族呈寡克隆分布。近来研究发现γδ+T细胞具有免疫调节功能，也可能参与GVHD的发病机制。然而，关于G-CSF动员是否影响外周血T细胞受体谱系的变化和T细胞信号转导分子的表达，目前尚无相关研究报道。为了探讨G-CSF对T细胞受体谱系和T细胞信号转导分子的影响，本研究分析了正常健康供者G-CSF动员前后外周血T细胞受体谱系以及CD3分子各亚单位基因的表达水平。 新近研究发现:具有免疫调节功能的Treg并不局限于CD4+T细胞，CD8+T细胞、CD4-CD8-T细胞以及γδ+T细胞也具有免疫调节功能的亚群。2009年，Kang等率先在正常小鼠体内发现了具有免疫抑制功能的调节性γδT细胞(regulatoryγδT cells，γδTreg)，该细胞属于γδ+T细胞，叉头翼螺旋家族转录抑制物p3(forkhead/winged-helix family transcriptional repressor p3,Foxp3)和CD25表达阳性，能抑制自身CD4+T细胞的增殖;同时，他们发现在肿瘤（肺癌、鼻咽癌、肾癌和胃癌）患者体内也存在该群细胞。随后，该研究组进一步发现:与健康人群相比，系统性红斑狼疮患者外周血γδTreg数量显著减少，且这种数量减少与系统性红斑狼疮的发展相关，因此提出:γδTreg有可能作为自身免疫性疾病新的治疗靶点。此外，研究发现:人外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMCs)经TCRγδ单克隆抗体（单抗）刺激和转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)诱导后可产生具有免疫调节表型和功能的γδTreg。然而，G-CSF的免疫调节功能是否能够影响γδTreg，目前尚不清楚。本研究分析了正常健康供者G-CSF动员前后外周血γδT细胞功能亚群的变化，并初步探讨G-CSF体外诱导生成γδTreg的可能性。 G-CSF动员的外周血干细胞移植降低GVHD发生率的作用机制至今尚未完全阐明，现研究大多是从直接途径和间接途径两条途径来考虑，从TCR和γδTreg角度来研究，目前尚无相关报道。因此，本研究目的在于明确G-CSF对外周血T细胞受体谱系、T细胞信号转导分子以及γδT细胞功能亚群的影响，探讨G-CSF体外诱导生成γδTreg的可能性，以进一步深入揭示G-CSF对T细胞的免疫调节效应，为研究G-CSF动员的外周血干细胞移植降低GVHD发生率的作用机制提供一条新的思路，为进一步降低GVHD、提高移植存活率提供新的免疫治疗策略。 方法： 1.采用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)-基因扫描检测20例供者G-CSF动员前后外周血TCRVα、Vβ、Vγ和Vδ亚家族T细胞分布和克隆性，实时定量RT-PCR检测20例供者动员前后外周血TCRVγⅠ-Ⅲ以及CD3γ、δ、ε和ζ基因表达水平，并结合临床资料观察供者外周血TCRVα、Vβ、Vγ和Vδ亚家族T细胞克隆性的变化情况与受者GVHD发生情况的关系。 2.采用流式细胞术检测15例供者G-CSF动员前后外周血γδT细胞功能亚群的表达比例，并结合临床资料观察供者动员后外周血γδT细胞功能亚群表达比例与受者移植后GVHD发生、原发病复发和生存的关系。 3.采用实时定量RT-PCR检测15例供者G-CSF动员前后外周血免疫调节相关分子和G-CSFR基因表达水平，液相芯片技术检测15例供者动员前后血浆细胞因子水平。 4.将正常人PBMCs放入含TCRγδ单抗、200 IU/mL白介素-2(interleukin-2，IL-2)和10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基的培养体系中进行γδT细胞的体外培养，并加入不同的细胞因子进行诱导。根据添加细胞因子的不同分成4组，分别为:①G-CSF组;②TGF-β组;③G-CSF+TGF-β组;④空白对照组(①-③为诱导实验组)。 5.采用流式细胞术检测体外培养后3个诱导组和对照组γδT细胞功能亚群表达比例，实时定量RT-PCR检测4组γδT细胞免疫调节相关分子和G-CSFR基因表达水平，羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester，CFSE)试剂盒结合流式细胞术以及细胞计数试剂盒(cellcounting kit-8，CCK-8)两种方法检测4组γδT细胞对自身CD4+T细胞增殖的抑制作用。 6.采用RT-PCR-基因扫描检测4组γδT细胞TCRVγ和Vδ亚家族分布和克隆性，实时定量RT-PCR检测4组γδT细胞TCRVγⅠ-Ⅲ基因表达水平。 7.采用液相芯片技术检测4组γδT细胞培养上清中细胞因子水平，CCK-8法检测4组γδT细胞的细胞毒活性，实时定量RT-PCR检测4组γδT细胞Perf和Grmb基因表达水平。 8.数据统计分析采用SPSS13.0统计软件包进行处理。G-CSF动员前与动员后外周血TCRVα、Vβ、Vγ和Vδ亚家族表达个数、TCRVγⅠ-Ⅲ以及CD3γ、δ、ε和ζ基因表达量、γδT细胞功能亚群表达比例、免疫调节相关分子和G-CSFR基因表达量以及血浆细胞因子水平的比较采用配对样本t检验。动员前后外周血TCRVα、Vβ、Vγ和Vδ各亚家族表达频率的比较采用卡方检验或Fisher检验。二分类logistic回归分析用于分析受者GVHD发生情况与供者TCRVα、Vβ、Vγ和Vδ各亚家族克隆性变化情况的相关性。因动员前后外周血各CD3基因表达水平不满足正态分布，不同CD3基因表达水平间的相关性分析以及供者年龄与G-CSF动员前后各CD3基因表达水平的相关性分析均采用Spearman秩相关分析。体外培养后3个诱导组和对照组γδT细胞功能亚群的表达比例、免疫调节相关分子和G-CSFR、TCRVγⅠ-Ⅲ等基因表达量、培养上清中细胞因子水平以及细胞毒活性等的比较采用单因素方差分析，当各组方差齐时，用LSD法作进一步多重比较;方差不齐时，用Welch法校正，并用Dunnett T3法作多重比较。供者动员后外周血γδT细胞亚群表达比例与受者移植后GVHD发生、原发病复发和生存的相关性分析采用Spearman秩相关分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。 结果： 1.G-CSF动员后外周血TCRVα、Vβ、Vγ和Vδ亚家族表达频率发生了不同程度地改变。G-CSF动员前后大多数TCRVα、Vβ、Vγ和Vδ亚家族均表现为多克隆分布。动员前20例供者中的2例分别在不同亚家族呈寡克隆，1例在TCRVα5，Vβ2，Vβ4和Vβ7中呈寡克隆，另一例在Vβ16中呈寡克隆;G-CSF动员后，20例供者中有5例Vβ16呈寡克隆分布。动员前20例供者中的3例在Vδ6呈寡克隆，动员后则有4例供者在不同Vγ和Vδ亚家族呈寡克隆，分别为VγⅡ、Vδ1、Vδ3和Vδ6。G-CSF动员后TCRVγⅠ，VγⅡ和VγⅢ基因表达水平较动员前显著下降(t=2.758，t=3.072，t=3.388; P=0.013，P=0.006，P=0.003)。动员前TCRVγ亚家族表达模式为VγⅡ＞VγⅠ＞VγⅢ，动员后变成VγⅠ＞VγⅡ＞VγⅢ。动员后供者TCRVβ22亚家族克隆性的改变与移植后患者GVHD的低发生率呈正相关(P=0.042，OR=12.500);动员后供者TCRVδ1克隆性增殖模式保持稳定与移植后患者GVHD的低发生率呈正相关(P=0.015，OR=0.047)。 2.G-CSF动员后外周血CD3ζ、CD3γ和CD3ε基因表达水平显著低于动员前(t=2.724，t=2.130，t=3.303; P=0.013，P=0.046，P=0.004)。动员前后CD3δ基因表达水平差异无统计学意义(t=1.930，P=0.069)。G-CSF动员前与动员后CD3各基因表达水平模式均为CD3ζCD3ε＞CD3δ＞CD3γ。 3.G-CSF动员后外周血Vδ1亚群比例显著高于动员前(t=-3.939，P=0.001)，总γδ T细胞和Vδ2亚群比例显著低于动员前(t=2.998，t=3.240; P=0.011，P=0.006)。动员后CD25+和CD27+亚群比例也显著高于动员前(t=-3.342，t=-3.077;P=0.006，P=0.015)，动员前后两组间Foxp3+亚群比例无统计学差异(t=0.302，P=0.768)。G-CSF动员后外周血Foxp3+Vδ1、CD27+Vδ1、CD25+Foxp3+、CD25+CD27+和CD27+Foxp3+Vδ1亚群比例均显著高于动员前(t=-2.711，t=-4.

目录

摘要

前言

第一章 G-CSF动员后外周血T细胞受体谱系变化

材料与方法

1．材料

2．方法

结果

讨论

第二章 G-CSF动员后外周血γδT细胞功能亚群变化

材料与方法

1．材料

2．方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

缩写词简表

攻读学位期间成果

致谢

声明

统计学审稿证明