脑梗塞急性期患者CD62E+微颗粒水平与病情严重程度、预后及血管危险因素关系的研究

摘要

研究背景与目的： 脑血管疾病是当前导致人类死亡的三大主要病因之一，具有高发病率、高病死率和高致残率等特点，对人类健康构成了重大威胁。其中，脑梗死约占所有脑血管疾病的75％。随着医学影像学技术的高速发展，目前脑梗死的鉴别诊断并不困难，但目前临床上尚缺乏对脑梗死的发生、进展及病情的严重程度、预后进行判断的高灵敏和特异的生物学标志物。因而，寻求反映脑梗死的潜在生物标志物一直是备受关注的热点。 血管内炎症反应、血管内皮功能不全及凝血异常是脑梗塞发病的重要病理生理基础。炎性因子和介质可通过受体或非受体依赖的途径作用于血管内皮细胞，引起内皮结构和功能的改变，促使内皮屏障遭到破坏，血管内皮损伤后会加剧血管的炎症反应以及内皮细胞下凝血物质的暴露，导致动脉粥样硬化斑块的进展及血液的高凝状态，而不断进展的动脉粥样硬化斑块破裂出血、斑块脱落及血栓形成又是导致脑血管急性闭塞和脑梗塞的主要原因。可见血管内皮损伤及功能障碍在脑梗塞的发病过程中扮演着重要角色，因此对血管内皮功能进行评估有助于筛查缺血性脑血管事件的易发人群，及时进行早期预防干预;除此之外，血管内皮损伤程度又与脑梗塞面积、脑梗塞严重程度等相关。因此，反映血管内皮损伤程度及内皮功能的生物标志物亦可能为脑梗死的及时诊断、治疗及预后判断带来诸多益处。然而，目前临床上用于评估血管内皮功能的手段主要是动脉血管超声指标，如内皮依赖性动脉流量介导的舒张功能(Flow-mediated dilation, FMD)等，这些检查方法操作繁琐，且易受干扰因素的影响，重复性差，在诊断应用中具有较大的局限性。因此，寻求一种方便、快捷、经济、高灵敏度和特异度的评估脑梗塞急性期病情严重和危险程度的生物标志物是目前缺血性脑血管病的重要研究方向。 内皮微颗粒(Endothelial Micro particles，EMP)是内皮细胞在凋亡或激活等状态下释放的直径＜1μm的囊性微颗粒，目前被认为是反映内皮功能障碍的主要生物标志。按EMP表面所携带母本细胞的特异性黏附分子（如CD144、CD31、CD105、CD146、CD62E等）的不同，可将其分成不同的表型。国外学者采用荧光标记这些特异性黏附分子的特异性抗体来捕捉血浆中的EMP，通过流式细胞仪定量计数血浆中不同EMP表型的数量，已经证实EMP多种表型的数量在多种疾病中明显增高，且不同的内皮微粒表型在疾病状态下亦表现出不同的临床意义。CD62E+内皮微颗粒是内皮细胞在活化时释放的表面携带有特异性CD62E（E-选择素）抗原的内皮微粒，国外研究证实CD62E+内皮微粒水平在急性脑梗塞患者的血液中呈现显著升高，且其数量与脑梗死严重程度、梗塞面积及预后等均有明显相关性，且与其它EMP表型相比，其与脑梗塞的关系更为密切，更能反映脑梗塞的临床情况，更具有临床潜在应用价值。但目前在我国脑梗塞急性期患者人群中，CD62E+内皮微粒与脑梗塞的关系，尚缺乏相关的研究资料，且CD62E+内皮微粒在脑梗塞急性期升高的原因及它与血管危险因素之间的关系目前均尚不清楚。因此，本研究拟探讨脑梗塞急性期患者血液中CD62E+内皮微粒水平与疾病严重程度、预后的关系，以评估CD62E+内皮微粒作为反映脑梗塞病情严重程度及预后判断生物标志物的价值，同时探究CD62E+内皮微粒水平的升高的原因，拓展对脑梗塞急性期病理生理过程的认识。 资料与方法： 1、临床资料 1.1研究对象选取2013年1月至2013年9月间于珠江医院神经内科住院诊疗的脑梗死急性期患者70例，其中男性38例，女性32例，年龄区间51-79岁，中位年龄61.6岁。纳入标准:①符合1995年全国第四届脑血管病学术会议制定的诊断标准;②经头颅CT或MRI明确诊断证实有脑梗死灶;③临床症状持续24 h以上，发病至入院时间在7天之内;④首次发病;⑤知情同意。排除标准:①既往有脑梗死史且有遗留神经功能缺损;②其他神经系统疾病（脑出血、阿尔茨海默病等）、恶性肿瘤、冠心病、肾病、血栓性疾病等;③合并有结缔组织病、风湿病、多发性硬化症等免疫系统疾病;④合并慢性炎症性及感染性疾病如胆囊炎、血管炎、肝炎等;⑤非动脉粥样硬化性血管病变及高凝状态等病因所致的脑梗塞;⑥有症状的外周动脉疾病;⑦溶栓治疗患者;⑧低体温者;⑨认知功能差，不能配合者。 选取同期于珠江医院就诊的70例非脑梗塞患者为对照组，所有入选者至少患有高血压病、糖尿病、高脂血症中的一项，且临床排除脑梗塞诊断，同时不合并急慢性感染、炎症、恶性肿瘤及颅内其它疾病。其中男女各35例，性别、年龄等因素均与脑梗死组匹配，组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。所有入选受试者均知情同意参与本次研究，并签署知情同意书。 1.2临床数据收集两组受试者均详细收录一般临床信息资料（包括性别，年龄，发病时间，高血压病史，糖尿病病史，高脂血症病史，吸烟史），高血压病诊断标准:既往确诊高血压目前正在接受高血压治疗或非同日血压检测3次以上均符合下列条件之一:(1)收缩压≧140mmHg;(2)舒张压≧90mmHg。糖尿病诊断标准:既往确诊糖尿病目前正在接受降糖药物或胰岛素治疗或符合下列条件之一:(1)空腹血糖≧7.0mmol/L;(2)随机血糖≧11.1mmol/L;(3)葡萄糖耐量试验2h血糖≧11.1mmol/L。高脂血症诊断标准:既往确诊高脂血症目前正在接受降脂治疗或空腹血脂符合以下条件之一:(1)总胆固醇＞6.1 mmol/L;(2)甘油三酯＞1.71 mmol/L;(3)低密度脂蛋白＞3.42 mmol/L。吸烟:吸烟指每日吸烟平均超过10支持续超过12个月。常规行血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C)、血糖、尿酸(Uric Acid，UA)、纤维蛋白原(Fibrinogen，FIB)、同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、脂蛋白相关磷脂酶A2(Lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2)、头颅MRI或CT检查及美国国立卫生研究院卒中量表(NIH Stroke Scale，NIHSS)评分，出院时行Barthel指数(Barthel Index，BI)评分。按照目前国际大型研究相关分组标准，将脑梗塞患者病情严重程度分为轻度组(NIHSS≤5)和中重度组(NIHSS＞5);根据BI指数将脑梗塞患者生活自理情况分为严重功能障碍组（0-40分）、中度功能障碍组（41-60分）、轻度功能障碍组（61-95分），正常组（96-100分）。 1.3研究对象随访电话或门诊随访3个月，登记患者临床终点事件（死亡、复发缺血性血管事件）发生情况。 2、标本检测 2.1实验主要试剂、仪器藻红蛋白标记的抗人CD62E单克隆抗体(CD62E-PE)、鼠抗人IgG-PE、直径0.82μm的校准微球均购自于美国BectonDickinson(BD)公司;10μm的Flow-CountTM荧光定量微球（103个/μl）购自美国Beckman-coulter公司，TC、TG、HDL-C、LDL-C、UA、凝血酶试剂购自于广州标佳科技有限公司，Lp-PLA2试剂盒购自天津康尔克生物科技有限公司，hs-CRP试剂购自于德国Siemens公司;FC500流式细胞仪（Beckman-coulter公司，美国），Infinite F50酶标仪(Tecan公司，瑞士)，AEROSET全自动生化分析仪（Abbott公司，美国），STAGO COMPACT全自动血凝分析仪(DiagosticaStago公司，法国)，BN ProSpec全自动特定蛋白分析系统（Siemens公司，德国），HA-8160分析仪（ARKRAY公司，日本）。 2.2标本收集与处理入院24h内抽取清晨空腹静脉血若干管，用促凝管收集行Hcy、 CRP、UA、TC、TG、HDL-C、LDL-C等指标检测，用枸橼酸钠(1∶9)抗凝收集静脉血行FIB检测，用EDTA抗凝管收集静脉血行Lp-PLA2、HbA1c检测，上述标本均送珠江医院检验中心进行检测。同时抽取清晨空腹静脉血6 ml，柠檬酸钠抗凝。1500×g，4℃离心10 min，重复2次，得到低血小板血浆;13000×g，4℃离心2rmin，得到无血小板血浆。取上层血浆置于-80℃冰箱冻存备用于CD62E+EMP的流式细胞检测，2h内处理完标本。 2.3检测方法采用流式细胞术检测CD62E+EMP水平，循环酶法测定Hcy水平，利用双抗体夹心-酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定Lp-PLA2、免疫散射比浊法测定CRP，终点法测定TC、TG、HDL-C、LDL-C，反相阳离子交换层析法测定 HbA1c。Hcy、CRP、Lp-PLA2、 chol、TG、HDL-C、LDL-C、HbA1c等均由珠江医院检验中心完成。 2.4 CD62E+EMP检测取出冰冻无血小板血浆，室温下解冻，充分震荡混匀，取50μl与5μ1 PE标记的CD62E抗体充分混合，避光孵育30min后，加入5μlFlow-CountTM荧光微球，再加入PBS液将体积调至1 ml，充分混匀后上流式细胞仪检测。对照管选用5μl鼠抗人IgG-PE作阴性对照。CD62E+ EMP值以个/μl表示。CD62E+ EMP（个/μl）=1000* EMP值/[Flow-CountTM荧光检测值*稀释倍数(10)]。 统计学方法： 利用SPSS17.0软件进行数据的整理和分析，其中计量资料采用均数±标准差的方式予以表示，计数资料采用百分比表示，偏态计量资料采用中位数（四分位间距）表示;正态分布资料两组间的比较应用独立样本的Student-t检验，计数资料的组间比较则采用x2检验，偏态资料两组组间比较采用Mann-Whitney U检验，多组比较采用Kruskal-Wallis H检验，变量之间的相关性分析利用Spearman分析法，采用Log-rank检验法分析生存情况，采用Cox模型确定界值。检验水准α=0.05，为双侧检验。 研究结果： 1、脑梗塞组和对照组患者一般资料和CD62E+EMP水平的比较 脑梗塞组中高血压43例，糖尿病18例，高脂血症24例;对照组中高血压46例，糖尿病16例，高脂血症27例。经统计学检验，脑梗塞组和对照组的年龄、性别、罹患高血压、糖尿病、高脂血症的比例的比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。脑梗塞急性期患者的每微升检测样本中含CD62E+内皮微颗粒数0-1236颗，中位数为50.5颗，对照组中位数为6.0颗，经Mann-Whitney U检验显示，脑梗塞组患者CD62 E+水平明显高于对照组，差异有统计学意义(Z=-4.496，P=0.000)。 2、脑梗塞急性期患者CD62E+水平与NIHSS评分和Barthel指数的关系 70例脑梗塞急性期患者均经NIHSS评分，其中NIHSS≤5分的患者有41例，占58.57％(41/70)，CD62E+水平中位数为18个/μl;而NIHSS＞5分组患者29例，占41.43％(29/70)，CD62E+水平中位数为94个/μl。经Mann-Whitney U检验显示，NIHSS＞5分组患者CD62E+水平明显高于NIHSS≤5分组，差异具有统计学意义(Z=-5.282，P=0.000)。此外，Spearman分析法对脑梗塞患者CD62E+水平与NIHSS评分进行相关性分析，显示CD62E+水平与NIHSS评分呈正相关关系(r=0.537，P=0.000)，表明脑梗塞急性期患者NIHSS评分值越高，其CD62E+水平亦越高。70例脑梗塞患者出院时行BI评分，其中BI0-40分37例(52.86％)，41-60分11例(15.71％)，61-95分22例(31.43％)，96-100分0

目录

摘要

前言

资料与方法

1、研究对象

2、数据收集

3、标本检测

3．1、标本收集与处理

3．2、主要仪器设备

3．3、主要试剂

3．4、检测原理及方法

3．5、标本的检测

4、统计学方法

研究结果

1、脑梗塞组和对照组患者一般资料和CD62E+水平的比较

2、脑梗塞急性期患者CD62E+水平与NIHSS和Barthel指数的关系

3、脑梗塞急性期患者CD62E+水平和血管危险因素的关系

4、脑梗塞急性期患者CD62E+EMP水平与缺血性脑血管病复发风险的关系

讨论

参考文献

附录1 缩略词中英文对照

附录2 美国国立卫生研究院卒中量表

附录3 Barthel指数评定量表

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