单核细胞趋化蛋白1诱导蛋白调节BV-2细胞的炎症因子表达

摘要

目的：
　　1.明确LPS或OGD/R干预下是否可诱导MCPIP在BV-2细胞中表达。
　　2.在LPS刺激下，探究MCPIP被敲低后是否增加BV-2细胞炎症因子表达并加重LPS诱导BV-2细胞的神经元毒性。
　　方法：
　　1.LPS刺激BV-2细胞诱导MCPIP表达
　　小鼠小胶质细胞株BV-2细胞用DMEM培养基加10％胎牛血清Fetal BovineSerum，FBS)培养，当BV-2细胞生长密度约80％时，用LPS(1μg/ml)在不同时间点(4，8，12及24h)分别刺激细胞。另外用不同浓度LPS(0.1，0.3及1μg/ml)分别刺激BV-2细胞4h，每组独立重复3次。最后用常规RT-PCR和Westernblot方法分别检测mRNA和蛋白表达水平，明确LPS刺激下BV-2细胞表达MCPIP的变化。
　　2.建立BV-2细胞的体外缺氧再灌注模型
　　用BV-2细胞进行OGD/R处理，模拟体外缺血再灌注状态。将OGD与REOX不同时间点之间的组合，将BV-2细胞分成7组，OGD1h/R3h、OGD1h/R24h、OGD2h/R3h、OGD2h/R24h、OGD4h/R3h、OGD4h/R24h及正常对照组，每组独立重复3次。用Western blot方法明确不同OGD/R时间点组合诱导BV-2细胞表达MCPIP的表达变化。
　　3.确立siRNA转染BV-2细胞的转染时间
　　将MCPIP特异性siRNA转染到BV-2细胞中（siMCPIP组），错义序列siRNA作为阴性对照(siControl组)。根据说明书操作说明将Lipofectamine2000(5μl/ml)和siRNA(50pM)混合后加到细胞培养基中转染。实验分为2组，一组siRNA转染细胞24h，另外一组siRNA转染细胞48h，实验独立重复3次，采用常规RT-PCR及DNA凝胶电泳最后确认转染效率，摸索转染效率较好的转染时间。
　　4.检测MCPIP敲低后BV-2细胞炎症相关因子的表达变化
　　实验分为两组，siMCPIP组以及siControl组。转染后用相同浓度LPS(1μg/ml)刺激BV-2细胞4h，提取总的RNA，逆转录后行荧光定量RT-PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,QRT-PCR)，特异性扩增MCPIP以及炎症因子IL-12b、IL-6、IL-1β、IL-23、即刻早期反应蛋白3(immediate early response3，IER3)、肿瘤坏死因子受体2(tumor necrosisfactor receptor2，TNFR2)、可诱导刺激分子(inducible costimulator，ICOS)的cDNA。实验独立重复3次，相对RNA表达量用2-ΔΔCt方法计算。
　　5.检测MCPIP敲低后BV-2细胞上清的对SH-SY5Y的神经元毒性
　　实验分为两组，siMCPIP组及siControl组。 BV-2细胞完成转染后，用LPS(0.1μg/ml)刺激细胞4h换新鲜DMEM培养基，继续培养24h并收集细胞上清。将细胞上清与神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞共孵育6h。3次独立重复实验，采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)法测量SH-SY5Y细胞的细胞存活率;用乳酸脱氢酶(dehydrogenase，LDH)释放实验测量SH-SY5Y细胞的死亡率。
　　6.统计分析
　　本研究全部数据均采用SPSS13.0统计分析软件进行分析，两独立样本实验方差齐的数据采用Student's t检验方法，方差不齐的数据采用Wilcoxon秩和检验。统计学结果以平均值±标准差((X)±S)表示，P＜0.05有统计学意义。
　　结果：
　　1.常规RT-PCR以及Western blot结果表明，相同浓度的LPS(1μg/ml)分别刺激BV-2细胞4、8、12和12h，LPS刺激4h后MCPIP的mRNA表达即显著增加并持续至24h（P＜0.01)。与此不同的是，MCPIP的蛋白表达水平也呈现时间依赖性，从4h开始缓慢增加并在12h到达表达高峰，但在LPS刺激24h后MCPIP蛋白表达明显下降。另外，不同浓度的LPS(0.1、0.3、1μg/ml)刺激BV-2细胞均可明显诱导MCPIP表达增高（P＜0.05)。
　　2.不同OGD/R时间点组合的干预下能诱导BV-2细胞MCPIP蛋白表达增加。Western blot结果表明OGD2h/R3h、OGD2h/R24h两组对BV-2细胞表达MCPIP蛋白的诱导能力较强。
　　3.BV-2细胞转染siRNA48h(P＜0.05)较24h(P＞0.05)能得到较好的敲低效率，siRNA转染48h后QRT-PCR结果显示MCPIP的敲低效率可达约60％。LPS刺激下，对siControl组，MCPIP敲低后会导致BV-2细胞的IL-6、IL-12b的mRNA表达增加（P＜0.05)，却显著降低了立即早期反应蛋白3(immediate earlyresponse3，IER3)的mRNA表达（P＜0.05），其他的炎症因子IL-1β、IL-23、TNFR2、ICOS的mRNA表达变化较阴性对照组无统计学意义（P＞0.05）。
　　4.LPS刺激BV-2细胞后收集细胞上清，然后将细胞上清与SH-SY5Y细胞共孵育后研究发现，MCPIP敲低后BV-2细胞的细胞上清具有更大的神经元毒性。对比siControl组，MCPIP敲低后的细胞上清与SH-SY5Y细胞共孵育，SH-SY5Y细胞存活率降低（P＜0.05）且细胞死亡率更高（P＜0.05）。
　　结论：
　　1.本研究通过体外实验验证了小胶质细胞株BV-2细胞可被LPS或OGD/R诱导表达MCPIP的表达，可为将来更进一步颅内炎症相关性疾病研究提供研究基础。
　　2.LPS刺激下，MCPIP调节BV-2细胞中炎症因子的表达，MCPIP敲低后BV-2细胞表达IL-12b、IL-6增加而IER3表达下降，进一步证明了小胶质细胞表达的MCPIP参与调控颅内炎症反应。
　　3.LPS刺激下，MCPIP敲低后BV-2细胞的细胞上清使SH-SY5Y细胞存活率降低、死亡率增高，说明在颅内炎症反应过程中MCPIP调节了小胶质细胞激活介导的神经元毒性作用，论证了MCPIP具有神经保护的潜在作用。

目录

摘要

前言

1．颅内炎症相关性疾病

2．单核细胞趋化蛋白-1诱导蛋白与炎症反应

3．研究内容及研究目的

材料与方法

1．实验材料与仪器

2．实验方法

3．统计分析

结果

1．LPS和OGD／R诱导BV-2细胞表达MCPIP

2．MCPIP调节BV-2细胞中炎症因子的表达

3．抑制MCPIP表达导致BV-2细胞的细胞上清神经元毒性增强

讨论

1．细胞模型及处理因素选择的合理性

2．LPS和OGD／R可诱导BV-2细胞MCPIP表达

3．MCPIP抑制小胶质细胞的炎症反应

4．MCPIP具有保护神经元的潜在作用

局限性与展望

全文总结

参考文献

中英文缩写词对照表

综述 单核细胞趋化蛋白1诱导蛋白与脑缺血

攻读学位期间成果

致谢

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