滤膜富集-光镜检验硅藻技术的建立及其法医学应用

摘要

目的:溺死(drowning)是由于液体机械性地阻塞呼吸道及肺泡，阻碍气体交换，使机体缺氧，二氧化碳潴留，导致其窒息死亡。我国沿海、沿江地区溺死的案件相对较多，水中尸体检验是法医工作中的重要内容。实际检案中，水中尸体死因多为溺死，但存在抛尸入水伪装成溺死的可能，因此水中尸体可能与刑事案件相关，必须进行法医学鉴定。溺水尸体可呈现出特有的病理征象，如口、鼻部蕈样泡沫，水性肺气肿，支气管内异物等。然而对于一些溺死病理不典型的尸体或是高度腐败的尸体，由于各种病理征象已不复存在，常需借助其它检验技术辅助鉴定溺死。溺死的辅助诊断方法有很多，但其或缺乏特异性，或受尸体腐败等因素的影响，或者理论、技术不成熟等，使这些方法难以应用于法医溺死诊断。溺水过程中，机体剧烈呼吸使溺液中的硅藻通过肺泡毛细血管屏障进入血管，随血液循环进入全身各个脏器，加之硅藻分布广泛和良好的抗酸性和耐腐蚀性使的硅藻检验对辅助鉴定溺死具有较强的优势。
　　目前，硅藻检验被认为是水中尸体尤其是腐败尸体溺死诊断较为可靠的证据。法医学硅藻检验实践中，主要由三个过程组成:消解、富集和观察。法医学者研究的硅藻检验方法多只针对消解过程进行优化，而忽略了将三个过程均进行优化，他们在实际应用时存在一些问题，如传统的强酸消解法消解程序简单，成本低廉，但存在富集效率较低，灵敏度低的问题;使用扫描电镜观察硅藻分辨率高，硅藻观察清晰，种类鉴定容易，但其成本较高，使其应用范围受到限制。本课题旨在建立一种硅藻检出率高、操作简单、安全，对设备要求不高，检验成本低的硅藻检验方法，使其在硅藻检验过程中获得良好效果，并为基层法医学实验室提供一种合适的硅藻检验方法。
　　方法:方法建立:分别使用醇类、醛类、酸类、苯类、丁香酚、树脂类等试剂与水系滤膜(聚醚砜(PES)材料）、有机系滤膜（尼龙材料）和核孔滤膜（有机化合物材料）相互反应，探索建立一种基于滤膜富集和光学显微镜检测脏器及水样内硅藻的新方法，并对该法的操作步骤进行优化。
　　动物实验:10只新西兰大白兔耳缘静脉注射过量麻醉剂处死后提取肾脏待检;广州市区段珠江水样500ml。实验样本随机分为强酸消解-离心富集-光镜检验法组（A组）、微波消解-滤膜富集-扫描电镜联用法组（B组）、微波消解-滤膜富集-光镜检验法组（C组），每组20份样本;三组样本分别采用强酸消解-离心富集-光镜检验法（方法A）、微波消解-滤膜富集-扫描电镜联用法（方法B）微波消解-滤膜富集-光镜检验法（方法C）处理。观察指标为样本前处理时间、组织消解程度、硅藻总回收率、各硅藻种类回收率、应用效果。
　　尸体样本:收集2013年2月至2013年10月广州市水中尸体56例，其中明确溺死的尸体30例、明确死因为死后抛尸入水的尸体26例，并收集同时段广州市区陆地死亡的尸体30例。取上述案例尸体的肺、肝、肾组织和对照水样并分别采用强酸消解-离心富集-光镜检验法（方法A）、微波消解-滤膜富集-扫描电镜联用法（方法B）和微波消解-滤膜富集-光镜检验法（方法C）进行硅藻检验。观察指标为硅藻检出情况、样本前处理时间、观察效果和结果比对。
　　结果:方法建立:经使用7类试剂与3种滤膜交叉对比研究，结果显示丁香酚—乙酸混合试剂滴加在水系滤膜上立即使滤膜变透明，可直接在光学显微镜下观察，视野干净，硅藻观察清晰。同时，建立了一套新的硅藻检验方法:微波消解-滤膜富集-光镜检验法。
　　动物实验结果:三种硅藻检验方法处理2g兔肾组织所需的时间（不包括硅藻观察），方法A处理时间最长，方法B其次，方法C处理时间最短(P＜0.05)。方法A消解组织不完全，光镜下可见较多组织碎块，部分硅藻被碎块覆盖，光镜下计数和鉴定硅藻种类困难;方法B消解组织完全，无组织残留，硅藻表面纹理清楚，易于计数和鉴定种类;方法C处理样品后滤膜透光性好，满足光镜检验要求，消解组织完全，无组织残留，光镜下可见硅藻散在密集分布，可观察到硅藻表面纹理，光镜下易于计数和鉴定硅藻种类。三种方法的硅藻总回收率分别是2.6±1.7％、76.9±20.2％和54.2±23.1％。方法B硅藻总回收率最高，方法C其次，方法C最低(P＜0.05)。A、B、C三组硅藻各种类的回收率（均值±标准差）分别是2.95±4.11％、65.54±29.66％和45.31±29.69％。方法A硅藻种类回收率最低，方法C其次，方法B硅藻种类回收率最高(P＜0.05)。
　　尸体样本结果:方法A对溺死组肺中的硅藻种类为39.8±34.6％，硅藻数量为4936.3±9863个/10g，溺死组肝和肾的硅藻种类和硅藻数量均低于方法B和方法C。方法B对溺死组肺中的硅藻种类为69.6±38.5％，硅藻数量为52743.5±82018.8个/10g，溺死组肝和肾的硅藻种类和硅藻数量最高。方法C对溺死组肺中的硅藻种类为39.8±34.6％，硅藻数量为4936.3±9863个/10g，溺死组肝和肾的硅藻种类和硅藻数量高于方法A。方法A处理肺、肝、肾组织的时间较另两种方法长，方法B其次，方法C处理肺、肝、肾组织样本的时间最短(P＜0.05)。方法A对肝、肾的观察效果较差，硅藻检出量少;方法B对肺、肝、肾组织最好，视野干净，不影响硅藻观察;方法C对肺脏和水样的观察效果较方法B差，会有异物颗粒影响观察。
　　结论:本课题建立了一种基于滤膜富集的光学显微镜观察硅藻新技术。消解液中的硅藻富集至水系滤膜（聚醚砜材料）后，可与丁香酚-乙酸试剂相互作用，使滤膜能直接置于光学显微镜下观察。将溺死尸体、死后入水尸体和陆地死亡尸体的样本采用微波消解-滤膜富集-光镜检验法进行硅藻检验研究，并同时比较了其它两种常用硅藻检验方法。本方法在实际案例检验过程中具有灵敏度高、能有效避免污染，且简单、高效、设备要求不高、易于推广等优点，适用于基层法医学实验室的硅藻检验。

目录

摘要

第一章 引言

1 研究背景

2 论文总体设计

第二章 滤膜富集-光镜检验硅藻技术的建立

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．3 滤膜富集-光镜检验技术的建立

2．4 滤膜富集-光镜检验技术的指标验证

2．5 本章小结

第三章 滤膜富集-光镜检验硅藻技术的法医学应用

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 应用案例

3．6 本章小结

第四章 总结

4．1 主要结论

4．2 下一步的研究工作

参考文献

附录

硕士在读期间成果

致谢

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