第一部分：去细胞脊髓支架复合骨髓基质干细胞治疗大鼠脊髓损伤的研究；第二部分：TSC-1基因敲除对脊髓损伤局部微血管的影响

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分去细胞脊髓支架复合骨髓基质干细胞治疗大鼠脊髓损伤的研究
　　目的:
　　脊髓损伤常导致脊髓损伤节段以下的运动感觉功能的丧失，对患者进行康复治疗，给社会和患者的家庭带来巨大的负担。鉴于此，大量的学者采用基于干细胞移植治疗脊髓损伤进行了尝试，部分研究取得了不错的实验效果，对损伤脊髓的康复发挥明显的促进作用。
　　多种人工合成材料、天然材料被用于合成修复脊髓损伤的支架，并复合各种干细胞修复脊髓损伤。基于人工合成材料合成的支架具有可降解性，极好的机械强度，能作为脊髓损伤局部的运输工具等优点;但这些支架也有不可忽视的缺点:如支架降解可使移植支架的局部环境有害降解产物聚集，改变损伤局部微环境，导致组织细胞的死亡（包括移植入体内的干细胞）。那么天然材料合成的支架是否没有这些缺点呢？已有的研究结果显示，基于天然材料合成的用于治疗脊髓损伤的支架有很好的吸附粘连性，降解产物不会改变损伤部位的微环境;然而这些天然材料合成的支架也具有如下问题:①物理支撑强度不高，②与损伤脊髓修复速度不匹配的降解率。因此，基于人工材料及天然材料合成支架都必须改进方能用于脊髓损伤的修复。目前有许多报道将去细胞组织支架用于脊髓损伤修复，去细胞组织支架拥有很多优良的天然属性:①三维立体空隙结构，②降解产物无毒性，③柔软的质地，④与损伤脊髓修复同步的降解率等优点，完全弥补了合成材料的不足;去细胞组织支架能很好的模拟细胞外基质，有很好的潜能促进神经的再生及促进功能的恢复。
　　由于相当容易获取以及较低的免疫抗原性，BMSCs是最好的治疗脊髓损伤的干细胞之一。使用骨髓基质干细胞修复脊髓损伤是因为这些细胞有潜能分化为神经组织来替损伤部位凋亡的脊髓组织。并且这些细胞移植入体内后还可以在损伤部位释放出大量的神经生长相关的因子，这些因子是神经组织的保护剂，同时还能促进神经轴突的发芽再生。这种基于干细胞移植的治疗策略需要移植入损伤部位大量的干细胞，并提高于细胞在体内的存活率，才能有效治疗脊髓损伤。
　　本实验中，我们采用去细胞脊髓支架复合骨髓基质干细胞治疗脊髓损伤，我们通过对大鼠半切损伤模型移植去细胞脊髓支架及BMSCs复合体，观察其是否能够保护大鼠损伤的神经组织及轴突，并促进脊髓损伤大鼠运动功能康复的作用。
　　方法:
　　1、骨髓基质干细胞的增值与鉴定。
　　2、去细胞脊髓支架的制作。大鼠，麻醉后(10％水合氯醛;60 mL/kg)取新鲜胸段脊髓置于4℃PBS溶液中。对脊髓的萃取参考已有文献:脊髓通过TritonⅩ-100(Amresco)和sodium deoxycholate(Amresco)萃取两次，0.01％ PBS溶液清洗三遍，每次1小时。冻干，辐照灭菌备用。
　　3、骨髓基质干细胞标记BrDU合并去细胞支架共培养。
　　结果:
　　1、BMSCs的鉴定
　　我们成功的冲胫骨及股骨的骨髓腔分离并扩增了BMSCs，并在细胞孵箱中培养至细胞的三代。将记过处理的第三代细胞BMSCs，放入流式细胞仪内，检测分析后得出如下结果:BMSCs表达造血细胞表面相关的表型CD34(2.32％)。强表达CD90(99.99％)，CD29(94.00％)，CD105(99.71％)及CD73(99.60％)(Fig.1)，本实验结果和已有相关文献报道的结果相符，证明本次实验所用细胞是骨髓基质干细胞。
　　2、去细胞脊髓支架复合骨髓基质干细胞移植入半切脊髓损伤
　　新鲜脊髓经过化学萃取后，留下了去细胞支架，去细胞脊髓支架显现出半透明，柔软的状态（Fig.-2 A），通过扫描电镜拍照，图片显示处理后的支架体现出较高的孔隙率;呈三维立体的多孔蜂窝状结构(Fig.2B)。经过马松三色染色法染色显示去细胞脊髓支架呈蓝色，由胶原纤维组成(Fig.2 C)。总数为5×105的BMSCs种植到去细胞脊髓支架上，加入20％胎牛血清的DMEM培养基在38℃培养2天，复合上细胞的支架相比未复合细胞的支架，由半透明变为乳白色，也具有更高的机械支撑强度。放到扫描电镜下，可见细胞很好的粘附到了支架的空隙里（Fig.2 D，E），HE染色可以看到细胞均匀分布在支架上(Fig.2，F)。支架细胞复合体在术后立即植入大鼠损伤部位。
　　结论:
　　本实验研究结果反映了去细胞脊髓支架联合BMSCs能够的明显促进脊髓损伤大鼠的运动功能的康复。去细胞支架复合物不但能促进损伤部位的神经的髓鞘再生，还能保护损伤部位受损伤的神经组织细胞免受二次损伤，因此细胞支架复合物在促进脊髓损伤大鼠的运动康复中起着重要作用
　　第二部分TSC-1基因特异性敲除对脊髓损伤局部微血管的影响
　　目的:
　　脊髓损伤后功能的恢复常取决于两种神经轴突的再生，一种脊髓损伤后残留的神经轴突的出芽再生，在损伤局部形成新的神经信号通路来替代受损伤的神经组织，使运动感觉功能得以部分恢复(1-2);另一种再生是损伤部位头侧的轴突向尾侧的长距离的桥接式再生，这些再生的神经束对运动感觉的恢复显得尤其重要(3-4)。尽管学者在实验模型上刺激损伤部位轴突再生做了大量的研究(1-4)，部分实验去除局部微环境中对轴突再生有抑制的基因(8-10)，部分实验为损伤局部输送各种神经生长因子(11)，但这些研究在促进轴突大量再生方面的作用十分却有限(5-16)。
　　定义哺乳动物雷帕霉素靶蛋白受体(mTOR)为一种相当保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，它能够整合了机体的营养、细胞间的生长因子及机体能量代谢和应激反应等多条信号通路的功能，从在机体内能有效控制细胞生长、增殖、存活与代谢。有些学者曾通过转基因老鼠敲除pTEN基因，使磷酸化AKT的活性使上升，从而抑制磷酸化TSC-1的活性，使mTOR活性上升，使损伤部位的轴突大量再生;该实验小鼠敲除PTEN基因，使P-akt活性大幅升高，然而P-akt活性升高可以通过MTOR信号通路以外的其余途径来促进脊髓损伤的修复;局部敲除PTEN基因的小鼠，P-Akt及mTOR的活性均升高，所以很难确认谁对促进损伤部位轴突的再生及功能康复的作用大一些。
　　有鉴于此，本实验旨在探讨通过腺相关病毒局部敲除中枢神经系统的TSC-1基因，从而使脊髓损伤局部mTOR活性上升，促进脊髓损伤修复的作用机制。
　　方法:
　　1、通过cre-loxp系统原理，本课题组成功构建了中枢神经系统局部特异性Tsc1敲除的小鼠模型。本实验通过使用western blot（蛋白免疫印记实验）实验及切片免疫荧光实验来确认了TSC-1基因的敲除效果。
　　2、通过对中枢神经系统局部敲除TSC-1基因的小鼠制作全横断脊髓损伤模型，并对小鼠密切护理和观察，对造模小鼠进行行为学评估及电生理检测。
　　3、通过组织免疫化学染色、免疫荧光，及Q-PCR检测技术评估局部敲除TSC-1基因，使mTORC1激活对造模小鼠的脊髓组织形态和结构的影响。
　　4、通过western blot检测局部敲除TSC-1基因后损伤局部的mTOR相关的蛋白及脊髓损伤修复的蛋白水平。
　　5、通过Q-PCR技术检测损伤局部新陈代谢加快的技术指标。
　　结果:
　　1、腺相关病毒有效感染细胞及宿主，并能有效敲除病毒注射处的TSC-1基因，使mTOR活性明显升高。
　　在本研究中，我们取C57、TSC-1 loxp/loxp两种小鼠的骨髓基质干细胞，并分别对两种细胞滴入AAV-GFP，AAV-Cre病毒，发现AAV-Cre病毒能使TSC-11oxp/loxp小鼠干细胞的p-S6活性上升，其余组未见明显变化。本结果说明AAV病毒能有效感染细胞，AAV-Cre病毒能敲除细胞的TSC-1基因。接着我们对C57、TSC-1loxp/loxp两组小鼠股四头肌局部注射AAV-GFP，AAV-Cre病毒，在注射AAV-GFP病毒的局部肌肉中，可以观察到GFP绿色荧光蛋白的表达;通过western blot检测及免疫荧光染色检测，我们可以观察到注射AAV-Cre病毒的TSC-1loxp/loxp小鼠的局部肌肉的p-S6活性明显改变，而C57小鼠组的没有明显的变化，这说明AAV-Cre病毒能在体内敲除TSC-1基因，使mTOR活性升高。
　　2、腺相关病毒有效敲除脊髓组织中的TSC-1基因，mTOR活性升高
　　我们进一步将两种AAV病毒注射到小鼠大脑的的运动皮质区域，两周后观察取胸8节段偏尾侧的脊髓组织做免疫荧光检查，结果显示AAV-Cre病毒注射组脊髓的p-S6活性明显比注射AAV-GFP组高;通过IPP软件对p-S6阳性染色组织进行统计，显示AAV-Cre组p-S6阳性染色组织是AAV-GFP组的2.75倍。
　　结论:
　　1、腺相关病毒有效感染宿主，并能有效的局部敲除中枢神经的TSC-1基因，使mTOR活性明显升高。
　　2、腺相关病毒在脊髓敲除TSC-1基因，未引起其余mTOR信号通路的基因改变。
　　3、腺相关病毒敲除基因组的术后运动功能大幅度提升，以及电生理改变明显。
　　4、腺相关病毒敲除基因组脊髓损伤部位微血管再生明显。
　　5、BDA逆行示踪显示腺相关病毒敲除基因组术后大量轴突再生。

目录

摘要

第一部分 脊髓去细胞支架复合骨髓基质干细胞保护脊髓损伤后的组织及促进运动功能恢复

1．1 前言

1．2 方法与材料

1．3 结果

1．4 讨论

1．5 结论

参考文献

第二部分 TSC-1基因特异性敲对脊髓损伤局部微血管的影响

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 结论

参考文献

综述 去细胞组织支架修复脊髓损伤的研究进展

附录

博士研究生期间发表论文情况

致谢

声明

统计学审稿证明