双孔钾通道TREK-2门控机制研究

摘要

研究目的:
　　钾通道为目前发现亚型最多、结构与功能最为复杂的一类离子通道，因其选择性通透钾离子特性而得名。钾通道广泛分布于中枢神经系统，同时外周如骨骼肌、心脏、血管、气管及腺体细胞等也有表达。生理功能上，钾通道主要参与维持细胞膜电位，调节可兴奋细胞的兴奋性，以及平滑肌的舒缩等过程。
　　TREK-2（TWIK Reelated K+ channel2，又称K2P10.1）为K2P家族成员之一，高表达于中枢神经系统，在外周神经系统和外周组织也有分布。在传统钾通道的离子电导通路上，从内到外依次排列着内门和外门，（又称C-型门，或失活门）。离子通道调控的门控机制是指离子电导通路通过移动特定的门控元件，或变化空间构象发生来实现对离子流入或流出的调控。
　　TREK-2的第二和第四跨膜片段同样存在甘氨酸铰链，但此甘氨酸铰链是否在内门活动中发挥功能？TREK-2通道中内门和外门是否存在耦联关系？TREK-2的C末端(Ct)是否影响门控机制及其可能的方式如何？TREK-2的Nt是否影响其离子选择器的构象？本研究应用TREK-2激动剂2-氨基乙基联苯基硼酸酯(2-Aminoethoxydiphenyl borate，2-APB)、胞外酸(pHo)和Ba2+作为工具，结合分子生物学和双电极电压钳技术，探讨以上几点未知问题，以期丰富TREK-2的门控机制理论。
　　研究方法:
　　(1)质粒构建，通道表达于非洲爪蟾卵母细胞中和双电极电压钳记录电流构建可以在非洲爪蟾卵母细胞中高表达的pGH-19-TREK-2和pGH-19-TREK-1重组质粒。根据研究目的的不同，应用PCR技术构建一系列结构不同的突变体、缺失体、嵌合体和串联二聚体，其中串联体的两个亚基应用一个可灵活变动的多肽连接，多肽氨基酸序列为AAAGSGGSGGSTGGSSGSSGS，以上各种突变体、缺失体、嵌合体和串联体质粒均经过DNA测序，结果与数据库比对以保证DNA序列正确。以上各种质粒应用XhoⅠ限制性内切酶酶切线性化，然后体外转录成cRNA，cRNA显微注射至非洲爪蟾卵母细胞，培养1-3天后，应用双电极电压钳技术，将细胞膜电位钳制在-80 mV，应用Ramp模式从-120mV去极化至+60 mV，时间150 ms，记录电流，观察它们在生理钾离子浓度(5mM)或者其他钾离子浓度（0 mM、20 mM或40 mM）条件下，对胞外给予不同浓度的2-APB或Ba2+的反应，以及它们对不同pH细胞外液的反应。
　　研究结果:
　　一、TREK-2内门对外门的调控作用
　　（一）2-APB激活TREK-2通道的机制研究
　　1)2-APB通过作用于TREK-2的C末端发挥其激活功能。
　　2)C末端近侧区为2-APB与TREK-2相互作用所必需，而远侧区发挥负调控作用。
　　根据序列比对结果，TREK-1和TREK-2的Ct近侧区(proximal Ct，pCt)相对保守，而远侧区(distal Ct，dCt)同源性较低。然而，缺失远侧区导致TREK-2对2-APB的敏感性显著上调，表明pCt为2-APB发挥功能所必需，而dCt则起着负性调节作用。
　　3)位于C末端近侧区的368位组氨酸为2-APB的结合所必需。
　　为进一步寻找2-APB作用的关键氨基酸，我们将TREK-2 pCt区内相对于TREK-1的非保守氨基酸（共7个）突变成TREK-1相应的氨基酸，并检测它们对2-APB的敏感性。结果发现，只有H368Y表现为敏感性下调，表明第368位组氨酸在2-APB开放TREK-2的过程中发挥了必不可少的作用。为鉴定该氨基酸涉及2-APB的结合还是通道的门控过程（即门控的公共元件），我们检测了H368Y对胞外pH值(pHo)变化的反应。结果表明，该突变体的行为与野生型相似。已知pHo变化通过引发外门构象变化调控通道活性，因此该氨基酸并不影响外门的功能，表明该氨基酸可能直接参与2-APB对TREK-2的结合。
　　4)2-APB通过促进TREK-2内门开放发挥其激活通道功能。
　　通过改变胞外钾离子浓度诱导TREK-2通道外门构象发生变化，并不影响2-APB的激活功能。另一方面，TREK-2的S4位点（第四个钾离子结合位点，位于外门的最内侧）突变体T172S和T281S对2-APB的敏感性也与野生型的相似。这些结果说明改变TREK-2的外门构象并不影响2-APB对TREK-2通道的开放，提示2-APB的作用与外门构象无关。第四跨膜区(M4)的甘氨酸铰链突变体(G312A)对2-APB的敏感性显著下调，而M4为内门的组成分，表明2-APB通过作用于内门激活TREK-2通道。
　　（二）TREK-2的门控机制特点探索
　　1)在甘氨酸铰链水平，两个亚基在TREK-2内门开放过程中呈协同合作(cooperative)方式。
　　为鉴定组成成熟TREK-2通道的两个亚基在2-APB诱导的内门开放过程中呈独立或者合作方式，我们构建了含有所有可能甘氨酸铰链突变组合的串联二聚体（含有两个M2甘氨酸铰链突变的除外，因为没有功能性通道表达），并检测它们对2-APB的敏感性。结果发现，单亚基突变体（共6种）对2-APB的敏感性与野生型串联分子(WT-WT)相似;双亚基突变体（共5种）对2-APB的敏感性下调。这些结果表明在甘氨酸铰链介导的内门活动中，两个亚基间并不是完全独立的，野生型亚基可完全补偿突变型亚基的功能，提示两个亚基间存在相互协同合作的关系。
　　2)外门构象的变化依赖甘氨酸铰链的活动。
　　为确定外门构象变化是否与甘氨酸铰链活动相偶联，我们检测了上述甘氨酸突变体对pHo变化的反应。结果表明，与对2-APB的反应极为相似:单亚基突变体对pHo的反应与野生型相当;而双亚基突变体中，除了G196A-G312A和G312A-G196A与野生型没有明显区别（对2-APB的反应也只与野生型有轻微差别），其它的均表现为敏感性显著下降。这些结果提示pHo引起的外门构象变化过程中，甘氨酸铰链介导的内门活动控制着外门活动，同时亚基间仍然相互合作。
　　3)C末端近侧区参与对离子选择器构象的调控。
　　根据以上结果，C末端近侧区与2-APB对TREK-2的结合密切相关，由于该区段在其它钾通道中通常为多种信号整合的关键结构域，我们也检测了该区段在TREK-2其它门控模型中的可能调控作用。首先，该区段缺失体表现为对2-APB的敏感性显著下调，与预期相符。另外，ΔpCt对pHo的敏感性也表现为显著降低，提示C末端近侧区也参与对离子选择器构象的调控，同时表明该区段为内门和离子选择器的公共调控元件。
　　4)C末端以亚基协同和顺式的方式调控TREK-2的内门和外门。
　　综上所述，C末端在TREK-2的整个门控机制中发挥了重要的作用，但其调控的模式未知。为解决这个问题，我们首先构建了单亚基C末端缺失体（串联二聚体WT-ΔCt和ΔCt-WT），并检测它们对2-APB和pHo的反应。结果表明，只保留一个亚基的C末端并不影响TREK-2对2-APB和pHo的敏感性，提示C末端对内门和离子选择器的调控为亚基协同方式。其次，进一步突变上述串联二聚体中野生型分子的甘氨酸铰链(ΔCt-G196AG312A)引起对2-APB和pHo的敏感性显著下调，表明位于不同亚基上的正常的C末端和甘氨酸铰链的功能并不能相互补偿，提示C末端调节内门和离子选择器的方式为顺式机制。
　　5)内门活动调控离子选择器构象的变化。
　　总结以上数据，我们发现在涉及甘氨酸铰链和C末端的突变体中，对2-APB不敏感的也表现为对pHo不敏感，反之亦然。既然甘氨酸铰链和C末端近侧区为控制内门活动的关键元件，同时根据TREK-2的结构特点，我们认为，在TREK-2的门控过程中，内门起主导作用，离子选择器构象变化完全受控于内门。
　　二、选择性翻译起始(alternative translational initiation，ATI)产生的三个TREK-2亚型拥有相似的离子选择器构象
　　已知Ba2+为检测离子选择器构象变化的有效工具。由于离子选择器序列在大多数钾通道中保守，我们检测了TREK-2对Ba2+的敏感性。
　　研究结论:
　　(1)本研究以同源性较高的TREK-1和TREK-2通道对2-APB的敏感相差悬殊为线索，对该化合物刺激TREK-2活性的机制以及TREK-2的门控特点进行了探讨。首先，我们发现该化合物主要通过与位于C末端近侧区的第368位组氨酸结合，并促进内门的开放而发挥其激活活性。随后，我们以2-APB和pHo分别作为研究内门和外门活动的工具，发现甘氨酸铰链和C末端（尤其是近侧区）为控制内门和离子选择器活动的重要元件，通道的两个亚基在门控过程中相互协同，而C末端和甘氨酸铰链以顺式方式（即位于同一个亚基的两种元件）相互调控。在TREK-2的门控过程中，内门处于主导地位，外门构象的变化完全依赖内门的活动。
　　(2)Ba2+通过与钾离子竞争结合于位于离子选择器内的第四个钾离子结合位点而抑制TREK-2通道的开放。以Ba2+和pHo为工具，我们发现由选择性翻译起始机制产生的三种亚型拥有相似的离子选择器构象。
　　我们的研究进一步丰富了双孔钾通道的门控机制内容，可为相关靶标的药物设计与开发提供理论指导。同时，2-APB、Ba2+和pHo可作为研究TREK-2通道或其它钾通道结构与功能的有效工具。

目录

摘要

前言

第一部分 TREK-2通道的内门控制离子选择器门的动力学特征研究

1．实验材料

2．方法

3．各种突变体和缺失体构建

4．数据统计

5．结果

5．1 质粒构建鉴定和表达

5．2 C末端影响2-APB对TREK-2的作用

5．3 C末端近侧区内的第368位组氨酸(His368)可能涉及2-APB与TREK-2的结合

5．4 2-APB通过开放内门激活TREK-2通道

5．5 在甘氨酸铰链水平，两个亚基以协同的方式使内门开放

5．6 胞胞外pH(pHo)变化引起的外门构象变化依赖甘氨酸铰链的运动

5．7 TREK-2的C末端近侧区参与内门和外门的门控过程

5．8 C末端以顺式(Cis-type)和亚基协同(cooperative)方式实现其对门控过程的调节

5．9 内门和外门之间的偶联关系

第二部分 选择性翻译起始机制产生的TREK-2亚型拥有相似的离子选择器构象

1．实验材料

2．方法

3．数据统计

4．结果

4．1 Ba2+对TREK-2电流的抑制呈浓度和时间依赖性

4．2 细胞外液K+浓度影响Ba2+对TREK-2电流的抑制

4．3 Ba2+通过结合在离子选择器内第四个钾离子结合位点(S4)抑制TREK-2电流

4．4 选择性翻译起始机制(ATI)产生的亚型的S4位点构象相似

4．5 ATI亚型拥有相似的离子选择器外侧构象

讨论

结论

参考文献

综述 TREK-1和TREK-2通道研究进展

攻读学位期间成果

英文缩略词表

致谢

声明

统计学审稿证明