EB病毒衣壳抗原(VCA)IgA及核抗原1(NA1)IgG时间分辨荧光免疫定量检测试剂的研制

摘要

目的:
　　EB病毒归类为疱疹病毒科γ疱疹病毒亚科嗜淋巴病毒属，可引起两种不同类型的感染，即增殖性感染和非增值性感染。EB病毒感染与人类多种疾病发生、发展有密切联系。包括传染性单核细胞增多症和B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、NK细胞淋巴瘤等免疫细胞性疾病;鼻咽癌、胃癌等上皮细胞性疾病。
　　VCA（viral capsid antigen）为病毒衣壳抗原。文献报道，血清EB病毒VCA-IgA抗体可以在鼻咽癌发生前10～61个月出现。患者的EB病毒抗体在高滴度水平波动，预示疾病进一步发展，提示其可能作为鼻咽癌早期诊断和鉴别诊断的标志物。在将来的鼻咽癌筛查计划中，将VCA-IgA抗体阳性者作为严密监测的人群，进行更密切的随访和严格的临床检查是十分必要的。血清中EB病毒VCA-IgA也可能作为评价鼻咽癌疗效和监测复发的观测指标。
　　时间分辨荧光免疫测定(Timed-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)利用具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物作为标记物标记抗原、抗体、激素、多肽或核酸探针等，待反应体系发生后，用TRFIA检测仪测量荧光，据此判断反应体系中待测物的浓度值，从而达到定量分析。TRFIA具有区别于其他标记免疫技术的优势:灵敏度高（10-18mol/孔）;操作简便;易自动化;标准曲线范围宽;不受样品自然荧光干扰;标记物制备简便且稳定;无放射性污染;可用于多标记等优点。
　　方法:
　　（一）采用间接法研制EB病毒衣壳抗原(VCA) IgA时间分辨免疫荧光分析定量检测试剂。
　　1.标准品及质控品的配制。
　　2.固相包被抗原的制备:包被液稀释VCA抗原到2.5μg/mL，100μL/孔加入微孔板中，4℃过夜。洗板后每孔加入200μL封闭液，4℃封闭过夜。吸去封闭液后真空抽干，-20℃冷冻保存。
　　3.Eu3+标记抗体的制备及纯化:0.5mg抗人IgA抗体洗涤离心6次，按质量比5∶1加入Eu3+标记试剂室温震荡过夜。用分子筛层析柱分离纯化，洗脱液洗脱收集，测量吸光度A280，收集高峰管混合，加入10％BSA保护。
　　4.反应系统的优化
　　4.1 最佳包被浓度:选取0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、2.5μg/mL、3μg/mL、3.5μg/mL、4μg/mL8个浓度梯度进行优化。
　　4.2 Eu3+标记抗体最佳稀释比:选取1∶400、1∶600、1∶800、1∶1000、1∶1500、1∶20006个稀释比梯度进行优化。
　　4.3 最佳反应时间的确定:选取20+20 min、40+40min、60+60 min、80+80 min、100+100min、120+120min6个反应时间进行优化。
　　5.参考值范围的确定。
　　6.性能指标的评价
　　6.1 标准曲线的绘制:由双对数数学模型Log-Log函数处理。
　　6.2 线性范围及分析灵敏度实验:平行测定20次A点（零剂量点）的荧光值，计算荧光值的平均值(X)及其标准差(SD)，以均值X+2SD的反应量代入上述标准曲线方程，计算分析灵敏度。
　　6.3 HOOK效应:用样品稀释液对标准品进行系列稀释，观察剂量反应饱和浓度点。
　　6.4 准确度实验:选择合适浓度的4个常规检测样本1mL，在其中的3份样本中加入不同浓度相同体积(0.1mL)的待测物标准液制备待回收分析样本，在另一份样本中加入同体积的(0.1mL)的样本稀释液，制备成基础样本。对制备好的3份分析样本和一份基础样本进行3次重复实验，计算均值和回收率。
　　6.5 精密度实验:三个不同时间各重复测量质控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ10次，计算分析间和分析内变异系数(CV)。
　　6.6 干扰性实验:称取不同质量的血红蛋白、甘油三酯和胆红素分别加入到质控品Ⅰ、Ⅲ中，使用自制的VCA-IgA检测试剂进行测定，各设3个复孔，计算各测值均数。
　　7.临床考核试验:以中山生物VCA-IgA ELISA检测试剂盒为对照试剂，本项目作为分析试剂，对171例临床样本进行同步检测，用SPSS13.0进行数据分析。
　　（二）采用间接法研制EB病毒核抗原1(NA1) IgG时间分辨免疫荧光分析定量检测试剂。
　　1.标准品及质控品的配制。
　　2.固相包被抗原的制备:包被液稀释NA1抗原到2.5μg/mL，100μL/孔加入微孔板中，4℃过夜。洗板后每孔加入200μL封闭液4℃封闭过夜。吸去封闭液后真空抽干，-20℃冷冻保存。
　　3.Eu3+标记抗体的制备及纯化:0.5mg抗人IgG抗体洗涤离心6次，按质量比5∶1加入Eu3+标记试剂震荡过夜。用分子筛层析柱分离纯化，洗脱液洗脱收集。测量吸光度A280，收集高峰管混合，加入10％BSA保护。
　　4.反应系统的优化
　　4.1 最佳包被浓度:选取0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、2.5μg/mL、3μg/mL、3.5μg/mL、4μg/mL8个浓度梯度进行优化。
　　4.2 Eu3+标记抗体最佳稀释比:选取1∶100、1∶150、1∶200、1∶300、1∶400、1∶6008个稀释比梯度进行优化。
　　4.3 最佳反应时间的确定:选取20+20 min、40+40min、60+60 min、80+80 min、100+100 min、120+120min6个反应时间进行优化。
　　5.性能指标的评价
　　5.1 标准曲线的绘制:由双对数数学模型Log-Log函数处理。
　　5.2 线性范围及分析灵敏度实验:平行测定20次A点（零剂量点）的荧光值，计算荧光值的平均值(X)及其标准差(SD)，以均值X+2SD的反应量代入上述标准曲线方程，计算分析灵敏度。
　　5.3 HOOK效应:用样品稀释液对标准品进行系列稀释，观察剂量反应饱和浓度点。
　　5.4 准确度实验:选择合适浓度的4个常规检测样本1mL，在其中的3份样本中加入不同浓度相同体积(0.1mL)的待测物标准液制备待回收分析样本，在另一份样本中加入同体积的(0.1mL)的样本稀释液，制备成基础样本。对制备好的3份分析样本和一份基础样本进行3次重复实验，计算均值和回收率。
　　5.5 精密度实验:三个不同时间各重复测量质控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ10次，计算分析间和分析内变异系数(CV)。
　　5.6 干扰性实验:称取不同质量的血红蛋白、甘油三酯和胆红素分别加入到质控品Ⅰ、Ⅲ中，使用自制的NA1-IgG检测试剂进行测定，各设3个复孔，计算各测值均数。
　　6.血清盘实验:用自制TRFIA试剂测量血清盘中7例阴性血清和14例阳性血清。
　　7.临床考核试验:以IBL NA1-IgG ELISA检测试剂盒为对照试剂，本项目作为分析试剂，对148例临床样本进行同步检测，用SPSS13.0进行数据分析。
　　结果:
　　（一）采用间接法研制EB病毒衣壳抗原(VCA) IgA时间分辨免疫荧光分析定量检测试剂。
　　本研究所建立的衣壳抗原(VCA) IgA TRFIA间接法的标准品六个点的浓度分别为A:0AU/mL、B:0.5AU/mL、C:1AU/mL、D:2.5AU/mL、E:10AU/mL、F:30AU/mL;最佳包被浓度、最佳Eu3+标记抗体稀释比、最佳反应时间分别为2.5μg/mL、1∶1000、60+60min; cut off值为2.20AU/mL;分析灵敏度及线性范围分别为0.029AU/mL和0.029～30 AU/mL;大于100AU/mL出现HOOK效应;回收率在89.44％～97.81％之间;分析间和分析内变异系数(CV)均小于10％;对血红蛋白、甘油三酯和胆红素血无交叉反应;与商业化ELISA试剂盒在灵敏度和特异性上无统计学差异。
　　（二）采用间接法研制EB病毒核抗原1(NA1) IgG时间分辨免疫荧光分析定量检测试剂。
　　本研究所建立的核抗原1(NA1) IgG TRFIA间接法的标准品六个点的浓度分别为A:0AU/mL、B:2.5AU/mL、C:10AU/mL、D:50AU/mL、E:200AU/mL、F:500AU/mL;最佳包被浓度、最佳Eu3+标记抗体稀释比、最佳反应时间分别为2.5μg/mL、1∶200、60+60min;分析灵敏度及线性范围分别为0.162AU/mL和0.162～500AU/mL;大于1765AU/mL出现HOOK效应;回收率为在106.50％～111.77％之间;分析间和分析内变异系数(CV)均小于10％;对血红蛋白、甘油三酯和胆红素血无交叉反应;血清盘测试与血清盘上阴阳性说明（7例阴性、14例阳性）相符;与商业化ELISA试剂盒在灵敏度和特异性上无统计学差异。
　　结论:
　　上述结果表明本研究研制的EB病毒衣壳抗原(VCA) IgA及核抗原1(NA1)IgG时间分辨荧光免疫定量检测试剂的各项指标（灵敏度、准确度、精密度、特异性等）均达到临床检测试剂要求，与同类ELISA产品性能相近，有望经进一步优化后应用于生产。

目录

摘要

前言

第一章 EB病毒衣壳抗原(VCA)-IgA定量检测时间分辨免疫荧光分析检测试剂的研制

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二章 EB病毒核抗原1(NA1)-IgG定量检测时间分辨免疫荧光分析检测试剂的研制

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

参考文献

中英文缩略词

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