稳定过表达CD44的ABC型弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株的建立及生物学功能的研究

摘要

目的：
　　本课题构建应用慢病毒载体LEGO-CD44-GFP以及对照组LEGO-GFP空载体来转染OCI-ly3(不表达CD44基因的ABC-DLBCL细胞株)，建立稳定过表达CD44基因及空载体的OCI-ly3细胞株，并进一步研究过表达CD44基因后对ABC-DLBCL细胞的生物学性状的影响及观察过表达CD44基因后ABC-DLBCL细胞对阿霉素药物敏感性的影响，为研究DLBCL的发病机制及寻找有效的靶向治疗手段提供理论基础。
　　方法：
　　1.慢病毒载体质粒的构建及无内毒素质粒的提取
　　1)T-A克隆:在PubMed Gene数据库中查阅CD44基因的CDS区（相对应的PubMed gene ID:960），根据酶切位点(PmeⅠ和AsisⅠ)设计引物，(CD44基因cDNA由广州复能基因有限公司购买)，使用高保真DNA聚合酶扩增目的基因，纯化回收目的片段，将其与pEASY-T载体连接后扩增，质粒小提、酶切鉴定正确后，用相应的酶进行酶切并回收目的基因片段;
　　2)表达载体质粒的构建及质粒提取:用AsisⅠ和PmeⅠ对载体骨架进行双酶切，使之与目的基因露出相同的粘性末端，回收的目的基因片段及载体骨架片段按照适当的比例混合连接扩增，质粒小提试剂盒提取质粒，酶切鉴定。若鉴定为正确克隆，则送公司进行DNA序列测序，并将测序结果与NCBI基因库中的序列比对。将以上成功构建的表达载体及辅助质粒摇菌扩大培养，用质粒大提试剂盒大量提取质粒（洗脱过程注意无菌操作），提取后质粒放于-20C保存，为后续细胞转染使用。
　　2.病毒包装及感染目的细胞
　　用PEI转染法转染293T细胞，24h后倒置荧光显微镜下观察GFP的表达情况，并分别于24h、48h和72h收集病毒上清，超速离心浓缩病毒，之后感染目的细胞OCI-ly3细胞，分别于第3、5、7天FACS检测转染后GFP的表达量。于第8天检测OCI-ly3、OCI-ly3-GFP、OCI-ly3-CD44-GFP细胞株中GFP阳性细胞CD44的表达量，并进行流式分选，将分选后各组OCI-ly3细胞进行扩大培养。应用RT-PCR法、Western Blot及流式细胞术从mRNA及蛋白水平验证CD44基因是否成功过表达。
　　3.观察过表达CD44对OCI-ly3细胞的生物学性状影响
　　扩大培养OCI-ly3、OCI-ly3-GFP、OCI-ly3-CD44-GFP细胞株，通过MTT法、流式细胞术、Transwell法检测过表达CD44基因后对OCI-ly3细胞的增殖、凋亡及迁移的变化。
　　4.检测过表达CD44后OCI-ly3细胞对阿霉素敏感性的影响。
　　MTT法检测稳定过表达CD44基因后OCI-ly3细胞对不同浓度阿霉素作用48小时后的细胞活力及半数抑制浓度(IC50)的变化;AnnexinⅤ-APC染色法流式细胞术检测0.5uM阿霉素作用24小时后各组OCI-ly3细胞的凋亡率。
　　5.数据分析
　　采用SPSS13.0软件进行统计分析，单因素均数比较采用One-Way ANOVA方差分析，LSD进行多重比较。多因素均数比较采用析因设计分析，计量资料使用用x±s表示，p＜0.05表示差异有统计学意义。FlowJo软件处理流式数据。
　　结果：
　　1.CD44过表达的慢病毒载体的构建
　　慢病毒表达载体质粒通过双酶切鉴定证实与实际大小相符合(CD442226bp，电泳胶图实际大小接近2.2kb)，送公司质粒测序，结果与NCBI数据库进行BLAST基因序列比对一致。
　　2.包装病毒及转染OCI-ly3细胞
　　以PEI阳离子基因转染试剂将LEGO-GFP空载体及LEGO-CD44-GFP转染至293T细胞进行病毒包装，24h后荧光镜下可见大量荧光，分别于转染后24h、48h和72h收集病毒上清，将三次收集的病毒上清超速离心浓缩病毒，加入适当的浓缩后病毒于OCI-ly3细胞中，72h后流式上机检测GFP阳性细胞分别为:空载体组OCI-ly3-GFP:15.6％，过表达CD44基因组OCI-ly3-CD44-GFP:5.35％。扩大培养至第8天，流式检测各组OCI-ly3细胞中GFP阳性CD44阳性细胞的表达情况，结果示:未转染组OCI-ly3细胞:0％，空载体组OCI-ly3-GFP:0％，过表达组OCI-ly3-CD44-GFP:98.0％。将GFP阳性细胞分选后，从mRNA及蛋白水平上证实了CD44基因在OCI-ly3细胞中被过表达。
　　3.过表达CD44对OCI-ly3细胞的生物学性状影响的结果
　　1)MTT法检测细胞增殖情况:OCI-ly3、OCI-ly3-GFP、OCI-ly3-CD44-GFP三组细胞的增殖率差异有统计学意义(F=263.94; p＜0.001)，三组细胞分别在0h、24h、48h和72h时进行两因素析因设计的方差分析，结果显示:随着时间的延长，各组细胞增殖活性（OD值）逐渐增加(F=38.994; P＜0.001);0h时3组细胞的OD值无显著差异(P=0.618)，24h、48h和72h时3组细胞OD值有显著差异(P=0.004; p=0.001;p=0.010)。
　　2)AnnexinⅤ-APC/PI凋亡试剂盒检测过表达CD44基因后对OCI-ly3细胞凋亡的影响，检测结果显示: OCI-ly3、OCI-ly3-GFP和OCI-ly3-CD44-GFP三组细胞之间细胞凋亡差异无统计学意义(p=0.676)。
　　3)Transwell法检测细胞迁移的结果示:与OCI-ly3、OCI-ly3-GFP组细胞相比，OCI-ly3-CD44-GFP组细胞迁移率增加(p=0.031)。 OCI-ly3-CD44-GFP和OCI-ly3-GFP、OCI-ly3细胞间迁移率有统计学差异(p=0.041，p=0.013)，而OCI-ly3-GFP和OCI-ly3细胞间迁移率无统计学差异(p=0.420)。
　　4.过表达CD44后对阿霉素药物敏感性影响的结果
　　(1)稳定过表达CD44基因的OCI-ly3细胞在不同浓度ADM作用48h后，MTT法检测结果发现，过表达CD44基因组OCI-ly3-CD44-GFP细胞活力明显高于相应浓度下未转染组OCI-ly3细胞与空载体组OCI-ly3-GFP细胞活力(p＜0.001;p＜0.001);相应浓度下，未转染组和空载体组之间细胞活力无显著性差异(p=0.528)。过表达CD44基因组IC50（0.348±0.072uM），明显高于未转染组（0.138±0.029uM）(p＜0.05)和空载体组(0.131±0.038uM)(p＜0.05)，未转染组和空载体组之间IC50值并无显著性差异(p=0.857)。
　　(2)经0.5uM浓度的阿霉素作用后24h后AnnexinⅤ染色流式细胞术检测各组细胞的凋亡率结果显示:过表达CD44基因组凋亡率比未转染组与空载体组的凋亡率低，三组细胞间细胞凋亡率的差异有统计学意义(p＜0.05，p＜0.05)，丽OCI-ly3-GFP和OCI-ly3细胞间凋亡率无统计学差异(p=0.987)。
　　结论:
　　我们利用分子克隆技术，成功构建过表达CD44基因的慢病毒载体，建立了稳定过表达CD44基因OCI-ly3细胞株。过表达CD44基因后，促进OCI-ly3细胞的增殖、迁移能力，而对凋亡无影响。过表达CD44基因后，增强了OCI-ly3细胞对阿霉素的耐药性。

目录

摘要

前言

第一部分 慢病毒介导的稳定过表达CD44的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株的建立

1 实验材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 稳定过表达CD44基因的ABC-DLBCL细胞生物学功能的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

全文小结

本文创新点、不足与展望

参考文献

硕士期间成果

致谢

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