低表达DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)基因对膀胱癌细胞生长和阿霉素耐药性影响的体内外研究

摘要

目的：1.探讨DNMT3b低表达对膀胱癌细胞T24、5637和BIU-87增殖、凋亡的影响;并观察DNMT3b低表达对生长和凋亡相关基因RASSF1A、DAPK、Bax和Bcl-2的表达及启动子甲基化的调控作用。从分子生物学水平阐述DNMT3b沉默导致膀胱癌细胞株生物学行为变化的分子生物学机制。
　　2.探讨DNMT3b低表达对野生型膀胱癌细胞BIU-87及阿霉素耐药细胞(BIU-87/ADM)阿霉素敏感性的影响;并观察DNMT3b低表达对耐药相关基因RASSF1A和hMLH1的表达及启动子甲基化的调控作用。从分子生物学水平探讨DNMT3b沉默与膀胱癌细胞化疗药物敏感性改变的相关性及可能的分子生物学机制。
　　方法：1.低表达DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡影响的体内外研究
　　1.1 细胞培养及siRNA转染
　　1.2 荧光定量PCR
　　1.3 Western blot
　　Western blot技术检测转染后T24、5637和BIU-87细胞株中DNMT3b蛋白的表达;Western blot技术检测转染后BIU-87细胞株中RASSF1A、DAPK、Bax和Bcl-2蛋白的表达。
　　1.4 甲基化特异性PCR检测
　　1.5 MTT测定细胞增殖
　　1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡
　　1.7慢病毒包装及稳定细胞株筛选
　　1.8裸鼠成瘤实验
　　2.低表达DNA甲基转移酶3b（DNMT3b）基因对膀胱癌细胞阿霉素耐药性影响的体内外研究
　　2.1 细胞培养及siRNA转染
　　2.2 荧光定量PCR
　　2.3 Western blot
　　Western blot技术检测转染后BIU-87和BIU-87/ADM细胞株中DNMT3b、RASSF1A和hMLH1蛋白的表达。
　　2.4 甲基化特异性PCR检测
　　2.5 阿霉素药物敏感性实验
　　2.6 流式细胞仪检测阿霉素诱导的细胞凋亡
　　2.7 慢病毒包装及稳定细胞株筛选
　　2.8 裸鼠成瘤实验
　　3.数据分析
　　所有计量资料均采用均数±标准差表示，采用SPSS18.0统计软件进行分析，样本均数的比较采用Student'st检验和One-way ANOVA，双侧P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果:1.低表达DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡影响的体内外研究
　　1.1 siRNA-DNMT3b转染下调T24、5637和BIU-87细胞DNMT3b mRNA和蛋白的表达
　　1.2 DNMT3b低表达抑制T24、5637和BIU-87细胞的生长
　　1.3 DNMT3b低表达促进T24、5637和BIU-87细胞的凋亡
　　1.4 DNMT3b低表达对BIU-87细胞生长及凋亡相关基因表达的影响
　　1.5 DNMT3b低表达对BIU-87细胞生长及凋亡相关基因甲基化的影响
　　1.6 DNMT3b低表达稳定细胞株的构建及DNMT3b稳定低表达对裸鼠瘤体生长的影响
　　结果显示，BIU-87-shNC及BIU-87-shRNA中均成功表达绿色荧光蛋白(GFP)。荧光定量PCR和western blot的方法检测细胞中DNMT3b的表达水平显示LV3-shRNA-DNMT3b可以显著降低DNMT3b的mRNA和蛋白水平(P＜0.01)。
　　裸鼠皮下成瘤模型结果显示:注射细胞后7-19天，瘤体生长缓慢，BIU-87-shRNA和BIU-87-shNC组所成瘤体体积没有统计学差异;注射细胞20天和25天后的测量结果显示，BIU-87-shRNA组的瘤体的平均体积明显比BIU-87-shNC组小(P＜0.01)。饲养结束，将瘤体取下并进行拍照，BIU-87-shRNA组的瘤体的体积明显比BIU-87-shNC组小。说明，DNMT3b稳定低表达可以对裸鼠瘤体生长具有明显的抑制作用。
　　2.低表达DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)基因对膀胱癌细胞阿霉素耐药性影响的体内外研究
　　2.1 siRNA-DNMT3b转染下调BIU-87和BIU-87/ADM细胞DNMT3b mRNA和蛋白的表达
　　荧光定量PCR和western blot检测结果显示，与NC转染组相比，siRNA-DNMT3b转染可以显著的降低BIU-87和BIU-87/ADM细胞DNMT3b的mRNA和蛋白水平(P＜0.01)。说明，siRNA-DNMT3b可以有效干扰DNMT3b的表达，转染的细胞可以用于后续实验。
　　2.2 DNMT3b低表达对膀胱癌细胞阿霉素耐药性的影响
　　使用0，0.0125，0.025，0.05，0.1和0.2 mg/L的阿霉素处理BIU-87-NC和BIU-87-siRNA细胞，处理72 h后进行MTT检测，结果显示:经0.025，0.05和0.1 mg/L的阿霉素处理后，BIU-87-siRNA组的存活率与BIU-87-NC组相比有明显的降低(P＜0.05);但经最小浓度0.0125mg/L和最大浓度0.2 mg/L的阿霉素处理后，BIU-87-siRNA转染组的存活率与BIU-87-NC组相比没有明显的变化(P＞0.05)。
　　使用0，0.5，1，2，4和8 mg/L的阿霉素处理BIU-87/ADM-NC和BIU-87/ADM-siRNA细胞，处理72 h后进行MTT检测，结果显示:经1，2，4和8 mg/L的阿霉素处理后，BIU-87/ADM-siRNA组的存活率与BIU-87/ADM-NC组相比有明显的降低(P＜0.05);但经最小浓度0.5mg/L的阿霉素处理后，BIU-87/ADM-siRNA组的存活率与BIU-87/ADM-NC组相比没有明显的变化(P＞0.05)。
　　根据阿霉素处理后的存活计算各组细胞的IC50。BIU-87-NC组的IC50为0.18 mg/L，BIU-87-siRNA组的IC50为0.14 mg/L，说明低表达DNMT3b对于野生型BIU-87细胞的IC50没有明显影响。BIU-87/ADM-NC组的IC50为13.96 mg/L，BIU-87/ADM-siRNA组的IC50为7.10 mg/L，说明低表达DNMT3b可以明显降低BIU-87/ADM细胞的IC50。说明，低表达DNMT3b可以逆转BIU-87/ADM的耐药性。
　　2.3 DNMT3b低表达对阿霉素诱导的膀胱癌细胞凋亡的影响。结果说明，低表达DNMT3b可以促进BIU-87和BIU-87/ADM细胞阿霉素诱导的细胞凋亡。
　　2.4 DNMT3b低表达对耐药相关基因表达的影响。结果说明了低表达DNMT3b逆转BIU-87/ADM细胞阿霉素耐药性的作用可能与hMLH1表达上调有关。
　　2.5 DNMT3b低表达对耐药相关基因甲基化的影响。结果说明，DNMT3b低表达上调BIU-87、BIU-87/ADM细胞中RASSF1A和BIU-87/ADM细胞中hMLH1的表达与其启动子区域的甲基化水平降低有关。
　　2.6 DNMT3b低表达稳定细胞株的构建及DNMT3b稳定低表达对阿霉素处理的裸鼠瘤体生长的影响
　　结果显示， BIU-87-shNC、 BIU-87-shRNA、 BIU-87/ADM-shNC及BIU-87/ADM-shRNA中均成功表达绿色荧光蛋白(GFP)。荧光定量PCR和western blot的方法检测细胞中DNMT3b的表达水平显示LV3-shRNA-DNMT3b可以显著降低BIU-87、BIU-87/ADM细胞DNMT3b的mRNA和蛋白水平(P＜0.01)。
　　裸鼠注射各稳定细胞株后，每3天按照5mg/kg腹腔注射阿霉素，并对成瘤情况进行观察。裸鼠皮下成瘤模型结果显示:注射细胞后7-13天，瘤体生长缓慢，BIU-87-shRNA和BIU-87/ADM-shRNA组与对应阴性对照组细胞所成瘤体体积没有统计学差异;注射细胞后16-25天的测量结果显示，BIU-87-shRNA和BIU-87/ADM-shRNA组比对应阴性对照组平均体积小，差异有统计学意义(P＜0.05)。饲养结束，将瘤体取下并进行拍照，BIU-87-shRNA和BIU-87/ADM-shRNA组的瘤体的体积明显比对应阴性对照组小。这些结果表明，DNMT3b稳定低表达对阿霉素处理的裸鼠瘤体生长具有明显的抑制作用。
　　结论:1.DNMT3b低表达可能通过上调DAPK，Bax和RASSF1A基因，下调Bcl-2基因的表达，从而抑制T24、5637和BIU-87膀胱癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡。
　　2.DNMT3b低表达可能通过上调hMLH1基因的表达逆转耐药型膀胱癌细胞BIU-87/ADM的阿霉素耐药性。

目录

摘要

第一章 低表达DNA甲基转移酶3b基因对膀胱癌细胞生长和凋亡影响的体内外研究

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第二章 低表达DNA甲基转移酶3b基因对膀胱癌细胞阿霉素耐药性影响的体内外研究

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 结论

全文总结

参考文献

英文缩写略词表

成果

致谢

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