BAMBI对ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤的影响及机制研究

摘要

目的:
　　探讨激活素膜结合抑制剂(bmp and activin membrane-boundinhibitor，BAMBI)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人静脉内皮细胞(humanumbilical vascular endothelial cell，HUVECs)损伤的影响及其分子调控机制。
　　方法:
　　1.BAMBI在ox-LDL诱导的内皮细胞损伤中的作用
　　HUVECs分为以下六组:对照(control)组;ox-LDL组;BAMBI+ox-LDL组;pcDNA3.1+ox-LDL组;si-BAMBI+ox-LDL组;si-control+ ox-LDL组。MTT方法检测细胞增殖。流式细胞仪检测凋亡。RT-PCR检测mRNA水平。Western blot检测蛋白含量。流式细胞仪检测ROS水平。试剂盒检测亚硝酸盐和cGMP水平。
　　2.BAMBI通过调控TGF-β/Smad通路发挥生物学作用
　　HUVECs分为以下六组:对照（control）组;ox-LDL组;BAMBI+ox-LDL组;TGF-β+BAMBI+ox-LDL组;si-BAMBI+ox-LDL组;TGF-β+si-BAMBI+ox-LDL组。检测方法同方法1。
　　3.Ox-LDL/TLR4/NF-κB信号通路调控BAMBI/TGF-β通路
　　HUVECs分为以下八组:对照（control）组;ox-LDL组;BAMBI+ox-LDL组;CLI-095+BAMBI+ox-LDL组;PDTC+BAMBI+ox-LDL组;si-BAMBI+ox-LDL组;CLI-095+si-BAMBI+ox-LDL组;PDTC+si-BAMBI+ox-LDL组。检测方法同方法1。
　　4.miR-373调控ox-LDL诱导的HUVECs中BAMBI表达
　　HUVECs分为以下六组:对照(control)组;ox-LDL组;mimic+ox-LDL组;mimic+BAMBI+ox-LDL组;inhibitor+ox-LDL组;inhibitor+si-BAMBI+ox-LDL组。双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测miR-373与BAMBI的靶向关系，其他检测方法同方法1。
　　结果:
　　1.BAMBI在ox-LDL诱导的内皮细胞损伤中的作用
　　研究结果显示，BAMBI在ox-LDL诱导的HUVECs中表达下调。在ox-LDL诱导的HUVECs中，过表达BAMBI能够促进细胞增殖;降低细胞凋亡;下调炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和黏附因子E-selectin、VCAM1、ICAM1的表达;抑制氧化应激反应，降低ROS和MDA水平，同时提高SOD的表达;提高NO和eNOS的产生。当在ox-LDL诱导的HUVECs中抑制BAMBI表达时，作用与过表达BAMBI相反，抑制细胞增殖;促进细胞凋亡;上调炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和黏附因子E-selectin、VCAM1、ICAM1的表达;促进氧化应激反应并降低NO和eNOS的产生。
　　2.BAMBI通过调控TGF-β/Smad通路发挥生物学作用
　　研究结果显示，在ox-LDL诱导的HUVECs中，TGF-β、p-Smad2和p-Smad3的表达水平上调。过表达TGF-β能够部分逆转BAMBI过表达在ox-LDL诱导的HUVECs中的抗内皮细胞损伤作用，从而抑制细胞增殖;增加细胞凋亡;上调炎性因子和黏附因子的表达;促进氧化应激反应并降低NO和eNOS的产生。相反地，过表达TGF-β能够加剧BAMBI抑制在ox-LDL诱导的HUVECs中的促内皮细胞损伤作用。
　　3.Ox-LDL/TLR4/NF-κB信号通路调控BAMBI/TGF-β通路
　　研究结果显示，在ox-LDL诱导的HUVECs中，TLR4、p-IκB-α和p-p65的蛋白表达水平上调。TLR4抑制剂CLI-095或NF-κB抑制剂PDTC预处理能够上调BAMBI的表达，并且能够加强BAMBI过表达在ox-LDL诱导的HUVECs中的抗内皮细胞损伤作用，部分逆转BAMBI抑制在ox-LDL诱导的HUVECs中的促内皮细胞损伤作用。
　　4.miR-373调控ox-LDL诱导的HUVECs中BAMBI表达
　　研究结果显示，在ox-LDL诱导的HUVECs中，miR-373表达上调，能够靶向BAMBI mRNA3'-UTR来调控其表达。miR-373通过调控BAMBI介导的TGF-β/Smad信号通路发挥生物学作用。抑制miR-373表达，能够抵抗ox-LDL诱导的内皮细胞损伤，包括促进细胞增殖;降低细胞凋亡;下调炎性因子和黏附因子的表达;抑制氧化应激反应并提高NO和eNOS的产生。
　　结论:
　　综上所述，本研究结果表明在ox-LDL诱导的HUVECs中，BAMBI表达下调，其下游TGF-β/Smad通路激活。过表达BAMBI能够抑制TGF-β/Smad通路，促进细胞增殖;降低细胞凋亡;下调炎性因子和黏附因子的表达;抑制氧化应激反应并提高NO和eNOS的产生，从而抵抗内皮细胞损伤。抑制TLR4/NF-κB信号能够上调BAMBI的表达，提示TLR4/NF-κB/BAMBI通路在内皮细胞损伤中发挥重要的作用。另外，BAMBI是miR-373的一个靶基因，抑制miR-373通过上调BAMBI抵抗内皮细胞损伤。我们的研究揭示了TLR4/NF-κB（或miR-373）/BAMBI/TGF-β/Smad信号通路在内皮损伤中的调控作用，进一步阐释了内皮损伤的机理，为防治与内皮损伤相关的心血管疾病提供了理论依据。

目录

摘要

1．1 心血管疾病

1．2 动脉粥样硬化

1．3 血管内皮细胞与动脉粥样硬化

1．4 氧化型低密度脂蛋白与心血管疾病

1．5 BAMBI基因

1．5．1 BAMBI基因概述

1．5．2 BAMBI蛋白结构

1．5．3 BAMBI的生物学功能

1．5．4 TGF-β／Smad通路

1．5．5 TLR4／NF-κB通路

1．6 miRNA的研究进展

1．6．1 miRNA的调控机制

1．6．2 miRNA与心血管疾病

1．6．3 miRNA的鉴定和靶基因预测

1．7 小结与展望

第2章 BAMBI在ox-LDL诱导的内皮细胞损伤中的作用

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 实验仪器

2．2．2 实验材料及试剂

2．2．3 抗体

2．2．4 主要溶液配制

2．3 实验方法

2．3．1 细胞培养

2．3．2 细胞转染及药物处理

2．3．4 RNA抽提

2．3．5 RNA逆转录

2．3．6 实时荧光定量PCR

2．3．7 蛋白抽提及定量

2．3．8 Western blot检测

2．3．9 MTT检测

2．3．10 流式细胞仪检测

2．3．11 ROS含量测定

2．3．12 SOD及MDA含量测定

2．3．13 Nitrite及cGMP含量测定

2．3．14 统计方法

2．4 实验结果

2．4．2 BAMBI影响ox-LDL诱导的HUVECs细胞增殖

2．4．3 BAMBI影响ox-LDL诱导的HUVECs细胞凋亡

2．4．4 BAMBI影响ox-LDL诱导的HUVECs中凋亡蛋白的表达

2．4．5 BAMBI影响ox-LDL诱导的HUVECs中炎症因子的水平

2．4．6 BAMBI影响ox-LDL诱导的HUVECs中粘附因子的表达

2．4．7 BAMBI影响ox-LDL诱导的HUVECs中氧化应激的水平

2．4．8 BAMBI影响ox-LDL诱导的HUVECs中NO和eNOS产生

2．5 讨论

2．6 结论

第3章 BAMBI通过调控TGF-β／Smad通路发挥生物学作用

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 实验仪器

3．2．2 实验材料及试剂

3．2．3 抗体

3．2．4 溶液配制

3．3 实验方法

3．3．1 细胞培养

3．3．2 细胞转染及药物处理

3．3．3 细胞分组

3．3．4 Western blot检测

3．3．5 MTT检测

3．3．6 流式细胞仪检测

3．3．7 ROS含量测定

3．3．8 SOD及MDA含量测定

3．3．9 Nitrite及cGMP含量测定

3．4．2 BAMBI通过调节TGF-β影响ox-LDL诱导的HUVECs细胞增殖

3．4．3 BAMBI通过调节TGF-β影响ox-LDL诱导的HUVECs细胞凋亡

3．4．4 BAMBI通过调节TGF-β影响ox-LDL诱导的HUVECs中凋亡蛋白的表达

3．4．5 BAMBI通过调节TGF-β影响ox-LDL诱导的HUVECs中炎症因子的水平

3．4．6 BAMBI通过调节TGF-β影响ox-LDL诱导的HUVECs中粘附因子的表达

3．4．7 BAMBI通过调节TGF-β影响ox-LDL诱导的HUVECs中氧化应激的水平

3．4．8 BAMBI通过调节TGF-β影响ox-LDL诱导的HUVECs中eNOS／NO的表达

3．5 讨论

3．6 结论

第4章 ox-LDL／TLR4／NF-κB信号通路调控BAMBI／TGF-β通路

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 实验仪器

4．2．2 实验材料及试剂

4．2．3 抗体

4．2．4 溶液配制

4．3 实验方法

4．3．1 细胞培养

4．3．2 细胞转染及药物处理

4．3．3 细胞分组

4．3．4 Western blot检测

4．3．5 实时荧光定量PCR

4．3．6 MTT检测

4．3．7 流式细胞仪检测

4．3．8 ROS含量测定

4．3．9 SOD及MDA含量测定

4．3．10 Nitrite及cGMP含量测定

4．3．11 统计方法

4．4 实验结果

4．4．2 抑制TLR4／NF-κB信号通路对BAMBI表达的影响

4．4．3 抑制TLR4／NF-κB信号通路对过表达或干扰BAMBI表达的影响

4．4．4 TLR4／NF-κB心信号通路调控BAMBI介导的TGF／Smad信号通路

4．4．5 TLR4／NF-κB信号通路通过调控BAMBI影响ox-LDL诱导的HUVECs增殖

4．4．6 TLR4／NF-κB信号通路通过调控BAMBI影响ox-LDL诱导的HUVECs凋亡

4．4．7 TLR4／NF-κB信号通路通过调控BAMBI影响凋亡相关蛋白的表达

4．4．8 TLR4／NF-κB信号通路通过调控BAMBI影响炎性因子的表达

4．4．9 TLR4／NF-κB信号通路通过调控BAMBI影响黏附分子的表达

4．4．10 TLR4／NF-κB信号通路通过调控BAMBI影响ox-LDL诱导的氧化应激

4．4．11 TLR4／NF-κ3信号通路通过调控BAMBI影响ox-LDL诱导eNOS和NO产生

4．5 讨论

4．6 结论

第5章 miR-373调控ox-LDL诱导的HUVECs中BAMBI表达

5．1 引言

5．2 实验材料

5．2．1 实验仪器

5．2．2 实验材料及试剂

5．2．3 抗体

5．2．4 溶液配制

5．3 实验方法

5．3．1 细胞培养

5．3．2 细胞转染及药物处理

5．3．3 细胞分组

5．3．4 荧光素酶活性实验

5．3．5 实时荧光定量PCR

5．3．6 Western blot检测

5．3．7 MTT检测

5．3．8 流式细胞仪检测

5．3．12 统计方法

5．4 实验结果

5．4．1 miR-373靶向调控BAMBI

5．4．2 miR-373对BAMBI表达的影响

5．4．3 miR-373对过表达或抑制BAMBI表达的影响

5．4．4 miR-373对BAMBI介导的TGF-β／Smad信号通路的影响

5．4．5 miR-373通过调控BAMBI影响ox-LDL诱导的细胞增殖

5．4．6 miR-373通过调控BAMBI影响ox-LDL诱导的细胞凋亡

5．4．7 rniR-373通过调控BAMBI影响凋亡相关蛋白的表达

5．4．8 miR-373通过调控BAMBI影响炎性因子的表达

5．4．9 miR-373通过调控BAMBI影响粘附分子的表达

5．4．10 miR-373通过调控BAMBI影响ox-LDL诱导的氧化应激

5．4．11 miR-373通过调控BAMBI影响ox-LDL诱导的NO和eNOS产生

5．5 讨论

5．6 结论

第6章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

中英文对照缩略词表

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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