利用生物膜细菌建立骨折术后内植物相关骨髓炎动物模型

摘要

背景:
　　内植物相关骨髓炎是骨科及骨科创伤病人骨折固定术后的一种严重并发症。有研究表明，医疗器械相关感染占所有骨科感染的70％以上，并且由于治疗手段局限，常常导致感染性骨不连以及骨髓炎等棘手问题，并伴随了严重的社会经济影响。
　　动物模型是研究内植物相关骨髓炎最常用、最有效、最有价值的工具之一。骨髓炎研究中，髓内固定的动物模型被广泛应用，但是这类模型中的髓内固定并不像临床情况中一样在用稳定骨折的同时远端使用锁定钉，因而缺乏了旋转稳定性。然而，内固定的稳定性对骨折的修复和愈合起到至关重要的作用，在使用这些动物模型时，稳定性的缺失会对实验结果形成负面影响。选择钢板固定的方式或许是对稳定性缺失的一种合适的解决方法，但是目前大多数动物模型中并没有使用钢板作为内固定方式，而是选择不进行截骨处理。虽然这样避免了稳定性的影响，却也掩盖了骨折及其愈合过程与感染的相互影响，局限了其应用。
　　此外，骨髓炎动物模型过去通常使用漂浮细菌作为起始接种的病原体，但是随着细菌生物膜这一概念的提出，科学家们逐渐意识到漂浮细菌作为起始接种的局限性以及细菌生物膜在骨髓炎中所起到的重要作用。美国疾病控制中心(CDC)报告称，在所有感染中的60％是由细菌生物膜导致的感染。内植物表面形成细菌生物膜常常导致抗菌治疗面临失败，与漂浮细菌相比生物膜细菌对抗生素的耐药程度可以高达1000倍以上。因此，Williams等提出了一种新的使用成熟细菌生物膜代替漂浮细菌作为起始接种的内植物相关骨髓炎动物模型。但是，这一模型使用羊作为实验动物，仅在皮质骨表层局部进行处理，接种范围及骨折程度不足，不足以模拟临床常见骨折情况。
　　一般来说，动物模型为新的治疗手段提供基础研究，应当尽可能的反映临床情况。因此，我们期望建立一个股骨骨折钢板固定并用细菌生物膜作为起始接种的骨髓炎兔子模型，来改进上面提到的这些问题。我们的动物模型能够更加贴近临床情况，可以提供一个更好的工具来观察感染的进程、骨折的愈合以及评估内植物的材料和涂层的抗菌能力。
　　方法:
　　24只新西兰大白兔(NZW)随机分为相等的两组。用直径1mm的线锯在每只兔子的右侧股骨干中段进行截骨，并用一块5孔钢板及4枚螺钉进行固定。第一组（对照组）的钢板并不接种细菌，第二组（实验组）的钢板接种金黄色葡萄球菌(ATCC25923)的生物膜。所有兔子分别在第0、7、14、21天拍摄X线片，在术后21天取右侧股骨标本进行micro-CT扫描重建，脱钙处理后进行石蜡包埋切片并予HE染色行组织学观察。两组钢板分别取6块进行扫描电镜(SEM)以及共聚焦显微镜(CLSM)对生物膜进行观察与评估。
　　结果:
　　在第二组中（实验组），所有兔子均可明显观察到脓液形成，骨膜反应，皮质骨的破坏和吸收;所有钢板表面均可以观察到生物膜的形成。相反，对照组只有轻度的炎症反应，并没有脓液形成;钢板表面均整洁无感染表现。两组的组织学评分(P＜0.001)以及钢板表面的细菌半定量(P＜0.001)结果皆具有明显的统计学意义。
　　结论:
　　结果表明，我们成功建立了一个新的开放性骨折钢板内固定术后感染的兔子模型，为内植物相关骨髓炎的研究提供了新的工具。

目录

摘要

前言

第一章 研究背景

1．1 骨髓炎相关动物模型

1．1．1 骨髓炎动物模型的种类

1．1．2 内固定模型：急慢性骨髓炎

1．1．3 开放性骨折模型

1．1．4 假体模型

1．1．5 血源性模型

1．1．6 骨髓炎模型的评估方法

1．2 细菌生物膜的研究进展

1．2．1 细菌生物膜概念的提出及其特点

1．2．2 细菌生物膜的模型

1．2．3 细菌生物膜的检测方法

1．3 小结

2．1 实验动物与分组

2．2 细菌与钢板

2．3 细菌生物膜的培养方法

2．3．1 金黄色葡萄球菌单克隆菌株的获取

2．3．2 菌液浓度的测定

2．3．3 细菌生物膜的培养

2．4 手术操作

2．5 X射线照片和micro-CT扫描

2．6 扫描电子显微镜(SEM)

2．7 共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)

2．7．1 分离钢板表面的生物膜

2．7．2 LIVE／DEAD?生物膜活性染色

2．8 组织学观察

2．9 统计学分析

3．1 大体观察

3．2 X线照片

3．3 微计算机断层扫描(Micro-CT)

3．4 扫描电子显微镜(SEM)

3．5 共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)

3．6 组织学切片

第四章 讨论

4．1 实验动物及造模方法的选择

4．2 细菌的接种和检测方式

4．3 抗感染材料的研究方向

4．4 实验的不足与缺陷

第五章 结论

参考文献

攻读学位期间成果

致谢

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