下一代测序技术在遗传性共济失调诊断中的临床应用研究

摘要

遗传性共济失调(hereditary ataxia，HA)是一大类具有高度临床和遗传异质性的遗传性神经系统退行性疾病，占神经系统遗传性疾病的10％～15％。根据遗传方式分为常染色体显性遗传小脑性共济失调、常染色体隐性遗传小脑性共济失调、X-连锁共济失调和线粒体综合征伴共济失调。常染色体显性遗传小脑性共济失调的平均发病率为2.7/100000，常染色体隐性遗传小脑性共济失调的发病率约为3.3/100000。
　　HA的分子诊断主要依赖于基因检测，明确分子诊断有助于进行靶向治疗、遗传咨询。在下一代测序技术(next-generation sequencing，NGS)出现以前，遗传性共济失调的基因诊断依赖于毛细管电泳片段分析技术、一代测序技术。2005年，随着第一台NGS测序仪出现，NGS迅速发展并广泛应用于遗传性疾病的诊断，在NGS应用的十余年中，遗传性共济失调新基因的发现速率明显增快。但由于HA存在多种遗传方式及致病基因，因此，如何选择基因检测方法及检测基因是关键步骤，且下一代测序技术能同时检测多种基因，但随之也带来了大量变异数据，如何解读这些数据也直接影响分子诊断。
　　为了规范变异序列的解读，2013年美国医学遗传学与基因组学学会联合分子病理协会、美国病理学家协会成立了一个工作组来重新审视和修订序列变异解读的标准和指南，新的指南建议使用特定标准术语“致病的”、“可能致病的”、“意义不明确的”、“可能良性的”和“良性的”来描述孟德尔疾病相关的基因变异。此外，新指南也描述了如何基于典型的数据类型（如人群数据、计算数据、功能数据，、共分离数据）对变异进行五级分类的标准过程。这份指南的发表规范了基因变异的解读，各大基因检测公司均按其要求呈现基因检测结果并将变异分级。
　　从2013年1月开始，本中心对临床疑诊遗传性共济失调的患者进行基因检测，探讨下一代测序在遗传性共济失调诊断中的应用。
　　研究目的：
　　本研究的研究目的有：
　　1.建立规范的遗传性共济失调基因诊断流程;
　　2.对临床疑诊为“遗传性共济失调”患者进行基因分析并为家系提供遗传咨询;
　　3.探讨如何为共济失调患者选择基因检测方法及检测基因;
　　4.分析临床表型与基因型的关系;
　　5.探讨如何进一步解读下一代测序检测结果中存在的意义不明变异(variant of uncertain significance,VUS)。
　　研究方法：
　　2013年1月至2016年12月南方医科大学南方医院神经内科对临床疑诊遗传性共济失调的31例患者，在取得患方知情同意后，结合患者的临床表型及家族史，推测大概的疾病分类、遗传模式、涉及基因，根据基因缺陷的不同，采用不同的基因检测技术进行基因检测。对检测结果进行分析，对结果阴性患者再次排除其他病因，对高度怀疑遗传性疾病的患者改变基因检测方法或扩大基因检测范围。对难以直接提供诊断依据的临床意义未明变异(VUS)，进一步核对基因型与临床表型是否匹配，进行蛋白功能预测及家系验证，或进行细胞功能实验、动物实验来进一步验证，来对VUS进行升级或降级，最后提供分子诊断、针对性治疗及遗传咨询。
　　研究结果：
　　本研究纳入的31例患者中19例得到确诊，其中脊髓小脑共济失调3型(SCA3)9例，其次发作性共济失调有3例，脊髓小脑共济失调2型(SCA2)2例，唾液酸沉积症Ⅰ型2例，共济失调伴眼动失用2型(AOA2)1例，脊髓小脑共济失调14型(SCA14)1例，还有比较罕见的耳聋-肌张力障碍-视神经萎缩综合征1例，在最终确诊的病人中5个病例的致病性变异为本研究新的变异，文献未报道。另有7例检出临床意义未明变异尚未明确其致病性，5例阴性检出。
　　研究结论：
　　1.建立了本中心基因检测服务平台，规范了遗传性共济失调基因诊断流程。
　　2.本中心HA诊断率为61.3％，其中SCA3检出率最高，所以对有家族史及遗传早现现象的患者首选毛细管电泳片段分析。
　　3.本研究丰富了遗传性共济失调的临床表型及基因型。
　　4.各检测方法中，下一代测序运用频率最高，占52.9％，毛细管电泳片段分析占35.3％，一代测序占11.8％。
　　5.对VUS的解读是必要的，扩大样本量、多中心研究、数据共享将有助于VUS的解读。

目录

摘要

前言

材料与方法

1．研究对象

2．材料和仪器

3．测序平台、数据库及变异预测网站

4．下一代测序基因检测方法

5．三核苷酸重复变异检测方法(片段分析、Sanger测序)

结果

1．建立了规范化的遗传性共济失调基因诊断流程

2．31例HA疑诊患者基因检测结果

3．案例分析

讨论

1．HA的分子分类

2．下一代测序在遗传性共济失调的诊断率

3．临床表型对基因检测策略的影响

4．VUS是下一代测序解读的挑战

5．本研究的局限性

结论

参考文献

中英文缩略词对照表

攻读学位期间成果

致谢

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