瘦素在上皮性卵巢癌中降低紫杉醇类化疗药物敏感性的机制研究

摘要

目的：
　　卵巢癌是妇科恶性肿瘤中发病率第三但致死率最高的一种疾病，由于临床症状不显著以及广泛的化疗耐药现象，导致多年来治疗效果一直不理想[1]。其中，卵巢癌化疗抵抗一直是严重影响卵巢癌患者生存预后的关键因素之一[2]。虽然有关研究提出多种关于化疗抵抗发生的假说，但其中具体机制并不是十分清楚[3]。本研究通过分析数据库中不同化疗方案的上皮性卵巢癌患者体内瘦素表达水平与生存情况的关系，利用体外细胞化疗敏感性实验，流式细胞周期分析，染色质免疫共沉淀技术及基因集富集分析等方法研究了瘦素在上皮性卵巢癌化疗抵抗中可能存在的分子机制，从而探讨瘦素作为上皮性卵巢癌患者化疗方案评估及预后预测指标的可能性。
　　方法：
　　1、对TCGA数据库中1656例上皮性卵巢癌病人按照不同的化疗方案分组，利用Kaplan-Meier技术，分析瘦素表达量对总体生存率的影响;2、利用Oncomine，cBioportal等多种数据库进一步分析验证瘦素表达水平与疾病进展及生存预后之间的关系;3、利用Cell Counting Kit/WST-8(CCK8)法摸索各种常用化疗药在卵巢癌细胞系中应用的适宜浓度及对应IC50;4、体外细胞水平验证在外源性瘦素重组蛋白作用下卵巢癌细胞对一线化疗方案（顺铂+紫杉醇/多烯紫杉醇）的敏感性变化;5、利用流式细胞周期检测技术验证瘦素对紫杉醇类化疗药改变肿瘤细胞周期能力的影响;6、利用基因集富集分析(GSEA)技术寻找瘦素发挥紫杉醇类化疗药抵抗作用的下游基因集变化;7、利用转录因子预测网站及染色质免疫共沉淀技术(chip)寻找调控瘦素表达的上游转录因子;8、使用荧光素酶基因报告系统检测并验证瘦素上游转录因子结合启动区位点。
　　结果：
　　1、Kaplan-Meier plotter网站分析发现瘦素高表达患者在铂类联合紫杉醇类（紫杉醇n=220，多烯紫杉醇n=108）化疗方案中生存率显著低于低表达患者（紫杉醇p=0.0089，多烯紫杉醇p=0.0021）;2、多数据库联合分析发现瘦素本身高表达对卵巢癌患者的疾病进展及生存预后并没有直接影响;3、利用CCK8法细胞活性检测得到五种化疗药Paclitaxel(PTX，紫杉醇)，Docetaxel(TXT,多烯紫杉醇)，Cisplatin(DDP,顺铂)，Topotecan(TPT,托泊替康)，Gemcitabine(GCB，吉西他滨)在两株卵巢癌细胞株HO8910PM及OV15中对应的适宜曲线浓度及IC50值（表3）;4、体外细胞实验显示外源性瘦素重组蛋白的加入可以降低紫杉醇/多烯紫杉醇化疗药对卵巢癌细胞的杀伤作用;5、流式细胞周期检测发现，紫杉醇类化疗药的使用可以增加卵巢癌细胞停滞在G2/M期的细胞比例，而外源性瘦素重组蛋白的加入可以削弱这一效应;6、GSEA分析结果显示经过紫杉醇治疗的瘦素高表达患者与低表达患者相比，分子水平上出现了以HALLMARK-EPITHELIAL-MESENCHYMAL-TRANSITION(EMT)为代表的多种基因集富集现象;7、转录因子网站预测及染色质免疫共沉淀实验验证C/EBPα可能是瘦素的重要转录因子，可以结合瘦素启动区的0bp-3000bp处的多个结合位点（引物1，即ORF上301bp至655bp和引物9，2742bp至3000bp范围）;8、荧光素酶报告基因(lucifrase)活性检测结果显示在同样转入C/EBPα过表达质粒后，瘦素上游位点突变组荧光素酶活性显著低于未突变组，差异具有显著性(p=0.004427191，p=0.00896897,p=8.84211E-05,p=0.010116376)。
　　结论：
　　1、低瘦素水平更有利于铂类联合紫杉醇化疗的卵巢癌病人预后生存;2、在细胞水平，瘦素重组蛋白降低了紫杉醇类化疗药对卵巢癌细胞的杀伤作用;3、瘦素降低了卵巢癌细胞对紫杉醇类化疗药物敏感性，这一过程可能是通过活化EMT实现的;4、在卵巢癌细胞中转录因子C/EBPα可以结合瘦素上游启动区激活其转录翻译。

目录

摘要

第1章 前言

2．1．1 材料

2．1．2 主要试剂

2．2 方法

2．2．1 细胞复苏

2．2．2 细胞培养

2．2．3 细胞的冻存

2．2．4 化疗药物的稀释与保存

2．2．5 实时荧光定量聚合酶链锁反应(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，QRT-PCR)检测mRNA表达量

2．2．6 96孔板细胞培养及Cell Counting Kit／WST-8(CCK8)细胞活性检测

2．2．7 流式细胞学细胞周期检测实验

2．2．8 染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation，CHIP)验证瘦素上游转录因子

2．2．9 荧光素酶报告基因系统(Luciferase)验证C／EBPa在瘦素上游的结合位点

2．2．10 基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)对紫杉醇化疗后高表达瘦素与低表达者之间基因集富集差异进行分析

2．2．11 统计分析

第3章 结果

3．1 瘦素的基本信息

3．1．1 瘦素的基本结构和功能

3．1．2 数据库(Oncomine Main)中瘦素的表达情况分析

3．1．3 cBioPortal网站分析卵巢癌病人中瘦素的基因突变情况和蛋白水平与预后之间的关系

3．2 铂类联合紫杉醇／多烯紫杉醇治疗的卵巢癌患者中高表达瘦素者总体生存率显著低于低表达瘦素者

3．3 瘦素表达量对不同临床分期，病理分级的卵巢癌患者总体生存率无显著影响

3．4 瘦素重组蛋白在细胞水平降低了卵巢癌细胞对紫杉醇类化疗药物的敏感性

3．5 瘦素降低紫杉醇类化疗药作用下卵巢癌细胞停滞在G2／M期的细胞比例

3．6 转录因子C／EBPα与上游启动子区域结合启动瘦素对卵巢癌细胞的调控作

3．7 经紫杉醇治疗后的高表达瘦素者在肿瘤标志性效应特征基因集和KEGG的基因集中有明显的富集现象

第4章 讨论

第5章 综述

参考文献

附录

攻读学位期间成果

致谢

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