肺结核患者外周γδT细胞Vδ2-CDR3序列特征及其合成多肽结合抗原肽的筛选和鉴定

摘要

研究背景：许多研究已证实γδ T细胞在抗结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）感染免疫中发挥重要作用。人γδ T细胞受体（TCRγδ）主要由Vγ9和Vδ2组成，在健康人外周血γδT细胞中约80％为Vγ9δ2T细胞，对Mtb抗原的刺激具有显著增殖反应。已发现活动性结核病（TB）患者的外周Vγ9δ2T细胞数量和对Mtb抗原刺激的增殖活性均有明显降低。但是这类Vγ9δ2T细胞亚群在抗原识别以及克隆特征方面在TB患者和健康人之间有何不同，至今了解尚不完全。鉴于TCRγδ的γ或δ链V区的互补决定簇区3（CDR3）是识别抗原表位的关键位点，而目前对于TCRγδ所识别的Mtb抗原多肽表位也不完全清楚。因此从检测和分析TB患者γδT细胞Vδ-CDR3基因谱型和序列特征，有助于理解γδT细胞在抗原识别方面的克隆特征。另外根据TB患者的优势CDR3片段序列合成的肽片段，从噬菌体多肽展示库中筛选出Mtb相关性性的抗原表位。将有助于揭示γδT细胞识别Mtb抗原表位的机制，为Mtb感染的诊断和防治提供新的方法。
　　目的：检测和分析活动性肺TB患者外周血γδT细胞受体Vδ2链CDR3片段基因谱型和序列特征，应用Vδ2-CDR3优势片段序列合成肽在噬菌体多肽展示库中筛选Mtb抗原相关的多肽表位，并对合成的Mtb抗原多肽表位的激活人γδT细胞活性进行初步鉴定。为阐明TB患者的T细胞免疫应答机制以及免疫诊断和治疗研究提供新的科学依据。
　　方法：1.采集肺TB患者（n=27）和健康人（n=25）外周血分离PBMC提取RNA，用RT-PCR方法扩增TCRγδ的Vδ2基因CDR3片段，PCR产物通过基因扫描分析CDR3片段长度的多样性变化。
　　2. Vδ2-CDR3的PCR产物纯化后连接PMD18-T载体重组质粒，转化及阳性筛选后用菌落PCR法对重组阳性质粒进行鉴定，并对阳性质粒PCR产物进行基因扫描分析确定其CDR3长度；
　　3.对 Vδ2-CDR3的PCR产物基因扫描优势峰对应的大部分重组质粒转化阳性克隆，以及部分非优势峰对应克隆的CDR3基因片段，测定DNA序列，并分析和比较其编码氨基酸的特征。
　　4.从TB患者新鲜PBMC和正常人PBMC经Mtb耐热性抗原刺激增殖的T细胞扩增Vδ2-CDR3的最优势序列，合成多肽片段包被平板，加噬菌体7肽库温育后，先洗去未结合的噬菌体，然后洗脱并收获特异结合的噬菌体扩增。经3-4轮结合-淘选-扩增循环，富集特异性结合噬菌体,并经过DNA测序分析和ELISA验证阳性噬菌体，通过BLAST生物信息学分析和比对噬菌体展示多肽序列与Mtb抗原的相关性。
　　5.从特异性富集噬菌体的多肽序列中寻找到的与Mtb相关的肽表位序列，合成7肽片段后作为抗原刺激正常人和TB患者的外周血PBMC，用流式细胞术检测γδT细胞的增殖活性。
　　结果：1、对PBMC中TCRγδ的Vδ2-CDR3片段基因扫描结果显示：TB患者组（n＝27）优势峰占总峰的比率(0.2755±0.0619)较正常人组（n=25）（0.1979±0.0346）高，TB患者组的长度变化范围为（25.11±5.52）较正常人为（19.87±3.52）高，差异均有统计学意义（p<0.0和p<0.0）。
　　2、 TB患者TCRγδ的Vδ2-CDR3的片段数和最优势峰长度，与正常人比较无显著变化。
　　3、基因扫描分析显示CDR3转化阳性菌落PCR峰与CDR3的RT-PCR产物中的扫描峰有很好的对应关系；有意义的是最高频率菌落（占40％）的CDR3片段长度与PBMC的RT-PCR产物的基因扫描优势峰长度完全相同。
　　4、对CDR3转化的克隆（73个）的测序结果表明：TCR Vδ2–CDR3序列均由两端保守的侧翼序列和中间的多变序列组成；两端保守的侧翼序列由位于 N端的“CACD”和位于C端的“KLIFGKG”组成，多变的中间序列97号位均含有疏水性氨基酸残基。该其中TB患者优势取用DJ3片段。每位TB患者有自己的优势序列，患者间偶发现有共有序列。
　　5、从TB患者新鲜PBMC中Vδ2-CDR3的优势序列挑选2个，和从正常人PBMC经Mtb耐热性抗原刺激增殖的T细胞中Vδ2-CDR3序列挑选2个，合成的4条多肽片段与噬菌体七肽库经4轮淘选后，得到特异性结合的噬菌体多肽序列47条，选择其中最富集序列和有交叉序列的9条，经GenBank BLAST比对分析，发现有4条7肽序列与某些Mtb抗原的序列高度重合。
　　6、从4条与Mtb抗原相关性的噬菌体多肽序列挑选2条合成7肽片段，用于体外培养实验发现，对某些正常人和TB患者个体的γδT细胞有刺激增殖活性。
　　结论：
　　1. TB患者外周血γδT细胞中Vδ2 CDR3片段优势峰所占总峰比率比正常人的高，表明正常人γδ T细胞受体呈高斯分布，具有多克隆特点，而TB患者的显示寡克隆特点，提示TB患者的γδT细胞经历了抗原特异性增殖。
　　2 TCRδ2基因CDR3片段中间的多变序列含有疏水性氨基酸残基，推测其与抗原肽结合的亲和力有关。TB患者大多优势取用DJ3片段，提示其与Mtb抗原的特异性识别可能有关。
　　3.与健康人外周γδT细胞经Mtb耐热抗原扩增后的Vδ2 CDR3优势片段具有相同序列比较，TB患者的外周新鲜血γδT细胞的Vδ2 CDR3片段优势峰中序列呈多样化，提示不同TB患者的γδT细胞的不同克隆参与对Mtb抗原的免疫应答。
　　4、本研究鉴定了4个TB患者特异性γδT细胞Vδ2-CDR3序列，经噬菌体七肽库筛选获得4条Mtb相关的抗原肽表位，并选择其中2条合成7肽片段，初步证实对正常人和TB患者的γδT细胞有刺激增殖活性。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

1 前 言

2 材 料 和 方 法

2.1 实验所用细胞来源

2.2 主要试剂

2.3 仪器和设备

2.4 RT-PCR方法检测PBMC γδ T细胞Vδ2+亚群的mRNA表达

2.5 TCR Vδ2-CDR3基因PCR产物克隆、扫描和测序

2.6 V?2-CDR3序列合成多肽用噬菌体7肽库筛选特异性结合多肽

2.7 ELSIA检测筛选获得的单克隆噬菌体与CDR3δ多肽的结合特异性

2.8 合成七肽刺激人外周血γδT细胞活化和增殖活性的检测

2.9 统计学处理

3 结 果

3.1 TB患者PBMC中TCR Vδ2-CDR3多样性分析

3.2 PBMC中TCR Vδ2 –CDR3的氨基酸序列特点

3.3合成的四条肽筛选噬菌体随机七肽库

3.4筛选到的与结核杆菌相关的抗原肽具有刺激γδT细胞的作用

4. 讨 论

γδ T细胞识别抗原的已知表位

γδ T细胞TCR Vδ2链CDR3（CDR3δ）基因扫描谱型及序列

合成的四条TCRδ2-CDR3肽筛选噬菌体随机七肽库

5 结 论

参考文献

致谢

附录A噬菌体测序图

附录B

附录C英文缩略词表

附录D常用试剂配制

附录E

附录F 综述: T细胞的TCR-CDR3的研究进展