Piezo基因敲除载体与抗ToMV病毒载体的构建及转化农杆菌

摘要

植物中存在Piezo基因，而且与动物中该基因同源性较高，推测其编码蛋白的功能也应与压力有关，但是目前该基因在植物上的功能尚无任何报道。因此，本文利用TRIzol法提取番茄幼嫩果实的总RNA，PCR扩增番茄Piezo基因片段，利用在线工具寻找靶点，通过Overlapping PCR技术以pYLsgRNA-AtU3b-LacZ质粒为模板构建完整的sgRNA表达盒片段，采用“金门”克隆法将sgRNA表达盒克隆到PYLCRISPR/CAS9Pubi-N表达载体上，构建Piezo基因敲除载体，并成功转化农杆菌，旨在探讨Piezo基因在植物上的功能。 番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus，ToMV)是一类世界性分布的植物病毒，西红柿是其主要寄主，侵染西红柿后使栽培面积大幅下降造成农业重大经济损失。最近研究发现CRISPR/Cas13a系统是一种能够靶向和切割基因组单链RNA(ssRNA)分子的2类VI-A型核糖核酸酶，可被开发利用到抗植物RNA病毒研究中。本研究根据西红柿密码子偏好性合成高GC含量的Cas13a，以PYLCRISPR/CAS9Pubi-N质粒为模板扩增Pubi启动子和NOS终止子并将三者连接构建Cas13a表达体系片段;设计并合成靶向ToMV病毒的4个不同区域位点crRNA片段，以pYLsgRNA-AtU3b-LacZ质粒为模板扩增U3启动子及其终止子与crRNA片段连接构建crRNA表达片段，把Cas13a表达体系片段和crRNA表达片段与PYLCRISPR/CAS9Pubi-N骨架片段融合成一个质粒，并成功转化到农杆菌中，为Cas13a介导的西红柿抗病毒研究做基础。 综上所述，本研究利用CRISPR/Cas9系统成功构建了Piezo基因敲除载体;利用CRISPR/Cas13a系统成功构建了西红柿抗ToMV病毒载体。这些结果为研究Piezo基因在植物中的功能以及减少西红柿ToMV病毒提供有价值的帮助。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 基因组编辑技术

1．1．1基因组编辑技术概述

1．1．2基因组编辑技术发展历程

1．1．3 CRISPR／Cas与ZFN、TALEN比较

1．2 CRISPR／Cas系统

1．2．1 CRISPR／Cas系统基本结构

1．2．2 CRISPR／Cas系统技术原理

1．3 CRISPR／Cas系统在植物中的应用

1．3．1 CRISPR／Cas9系统在植物中应用

1．3．2 CRISPR／Cas13a系统在植物中的应用

1．4研究意义及主要研究内容

1．5创新点

1．6技术路线

2 ORISPR／Cas9基因敲除载体构建

2．1 实验材料

2．1．1植物材料

2．1．2实验试剂

2．1．3载体和引物

2．1．4常用培养基及抗生素的配制

2．2．1番茄幼苗叶片总RNA提取

2．2．2 RT-PCR方法获取cDNA

2．2．3 PCR扩增目标番茄基因片段

2．2．4 sgRNA的设计

2．2．5 sgRNA表达盒的构建

2．2．6 Cas9表达载体的构建

2．2．7 CRISPR／Cas9基因敲除载体的构建

2．3．1番茄幼苗叶片总RNA提取

2．3．2番茄Piezo基因片段扩增

2．3．3载体质粒DNA的提取

2．3．4基因敲除靶位点的设计与合成

2．3．5 Overlaping PCR构建sgRNA表达盒

2．3．6 Cas9表达载体构建

2．3．7重组载体质粒的提取

2．3．8重组质粒引物扩增鉴定

2．4讨论

3西红柿抗ToMV病毒载体构建

3．1 实验材料

3．1．1菌株

3．1．2酶、实验试剂盒

3．1．3载体和引物

3．2实验方法

3．2．2 Cas13a表达体系构建

3．2．3串联crRNA系统

3．2．4合适的植物表达体系元件

3．2．5各种质粒元件整合

3．3实验结果与分析

3．3．2 Pubi启动子与Cas13a连接片段

3．3．3扩增终止子片段

3．3．4构建Cas13a表达体系

3．3．5扩增U3启动子与crRNA

3．3．6 U3启动子与crRNA片段连接

3．3．7扩增合适的植物表达元件

3．3．8抗病毒载体质粒

3．4讨论

4重组载体的转化

4．2．3农杆菌转化子的筛选

4．3实验结果与分析

4．3．1 Piezo基因敲除载体转化

4．3．2西红柿抗ToMV病毒载体转化

4．4讨论

5结论与展望

5．1 结论

5．1．1 Piezo基因敲除载体构建

5．2展望

参考文献

附录

后记

攻读学位期间取得的科研成果清单