葡萄糖氧化酶的表达及其在半纤维素酶解方面的应用

摘要

木糖是一种单糖，它可以由半纤维素酶解得到。由于木糖不会导致糖尿病和肥胖等疾病的发生，它常常被用于作为蔗糖的替代品。过氧化氢(H2O2)预处理蔗渣可以促进分馏、溶解、水解和分离纤维素、半纤维素和木质素。而β-D-葡萄糖氧化酶（GOD）可以催化葡萄糖的氧化和氧气的还原并生成过氧化氢。因此，GOD也许能够取代H2O2的作用达到提高半纤维素水解效率的目的。为了验证这一推测，我们设计一系列的实验并对结果进行分析。
　　本研究中，为了提高GOD的表达量以及为后续的深入研究打下一定基础，我们构建并获得了两个单基因重组表达酵母。首先，黑曲霉CICC40179的GOD基因被克隆进载体pMD19-T。用BLAST进行序列分析表明这是一段新的未被报道过的GOD基因。3D结构模拟（DS2.5，Accelrys Software Inc.，San Diego，CA）比较了这个新的GOD蛋白和另一同源蛋白（Protein Data Bank登录号：No.1CF3_A），结果显示两个突变的氨基酸残基位于蛋白质结构的外侧部分，突变并没有改变其蛋白质的整体结构。将这段基因序列分别通过载体 p2μRCMB和pGAPZαA导入酿酒酵母AS2.489和毕赤酵母X33中进行表达。重组酿酒酵母表达的GOD蛋白分子量约为100 kDa，而重组毕赤酵母的GOD蛋白分子量则约为70 kDa，且重组毕赤酵母的GOD酶活显著高于重组酿酒酵母。选用重组毕赤酵母进行后续酶学特性、酶法水解等研究。GOD的最适 pH和温度分别为7.5和35℃，在25℃、30℃、35℃和40℃各培养2 h，酶活力几乎没有发生改变。因此，这个新的GOD可能是一种中温酶并且具有较为宽广的工作温度。金属离子Mn2+和Co2+能显著提高GOD的活性，然而Zn2+则显著的抑制酶活。对该重组毕赤酵母进行培养基成分正交优化，使得GOD的活性从4.9 U/mL（摇瓶酶活）提升至16.31 U/mL（SL-05发酵罐酶活）。
　　由于GOD的催化特性，本研究尝试将其应用于半纤维素酶解生产木糖的工艺过程。通过使用Box-Behnken响应面设计对GOD的酶量、pH和温度进行了优化，从而提高了木糖产量。最终获得的最适酶解参数为pH值5.1、温度44.9℃和GOD酶量31.68 U/g底物底物，在该条件下，实验组与对照组（未添加GOD）相比36小时的木糖生产效率从67.21％上升到了76.72%。这种新的酶法水解体系可大幅提高木糖的产率，为后续实现工业化生产木糖即蔗糖的良好替代品打下基础。

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第一章 引言

1.1 葡萄糖氧化酶

1.2 葡萄糖氧化酶的重组表达

1.3 培养基成分对葡萄糖氧化酶生产的影响

1.4 半纤维素

1.5 酶法水解半纤维素

1.6 响应面分析方法

1.7 本研究的目的和意义

第二章 葡萄糖氧化酶基因的克隆及鉴定

2.1 导言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5讨论

第三章 葡萄糖氧化酶基因分别在酿酒酵母和毕赤酵母中的表达

3.1 导言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 讨论

第四章 重组毕赤酵母P. pastoris-god的酶活特性及蛋白鉴定

4.1 导言

4.2实验材料

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 讨论

第五章 重组GOD提升酶法制备木糖产量的研究

5.1 导言

5.2 实验材料

5.3 实验方法

5.4 实验结果

5.5 讨论

第六章 总结与展望

参考文献

附录 缩略语

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致谢