溴及末端结构域蛋白(BET)抑制剂靶向YAP信号通路影响软骨肉瘤增殖的机制研究

摘要

目的：软骨肉瘤，是现今排名第二位的恶性骨肿瘤，并且容易对传统的放疗及化疗耐受，手术切除仍是当前软骨肉瘤的主要治疗方法。但是，很大一部分患者发生复发及耐药，因此有必要去发掘一种新的有效的治疗方式。近期，在肿瘤治疗中靶向作用表观遗传学调控因子如溴结构域蛋白（bromodomain and extraterminal domain BET proteins）已经取得了巨大成功，例如，溴结构域蛋白抑制剂JQ1在体内及体外实验中显示能抑制多种肿瘤的生长。本研究旨在探讨JQ1对软骨肉瘤细胞的作用及其分子机制。 方法：采用CCK-8技术检测JQ1作用前后细胞的吸光度值，采用克隆成形实验检测JQ1处理前后克隆生长情况，EdU法检测JQ1处理后细胞的增殖状况，流式细胞术检测JQ1处理后细胞周期及凋亡的变化，激光共聚焦显微镜下观察c-Myc免疫荧光染色，蛋白印记检测细胞周期相关蛋白、c-Myc及下游Bcl-XL及YAP信号通路的表达，采用免疫组化检测YAP在软骨肉瘤组织芯片中的表达。 结果：我们的研究显示，JQ1能明显抑制软骨肉瘤细胞的生长及克隆形成，JQ1也引起明显的G1期细胞周期阻滞，这也与p21WAF1/CIP1,p27Kip1,和Cyclin D1表达上升及Cyclin E2表达下降的结果相一致。另外，JQ1能引起软骨肉瘤细胞SW1353衰老，延长JQ1处理时间（48h）会引起细胞凋亡。并且，JQ1抑制软骨肉瘤细胞生长与c-Myc及Bcl-xL的表达相关，而c-Myc及Bcl-xL是调控细胞周期及抗凋亡的关键基因。进一步，发现在JQ1的作用下，p21能负调控c-Myc及Bcl-xL的表达。另外，JQ1抑制软骨肉瘤细胞SW1353及Hs819.T的生长，引起p21表达上升主要是通过LATS1/YAP信号通路，而不是p53依赖性的。最后，发现YAP在软骨肉瘤中高表达，且与疾病的病程相关。 结论：发现了一个新的机制：即JQ1通过调控YAP/p21/c-Myc/Bcl-xL信号轴引起软骨肉瘤细胞生长抑制，细胞衰老及细胞凋亡。

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1实验材料

细胞及细胞培养

1.2主要试剂

1.2.1培养基

1.2.2 主要试剂与抗体

1.3.1 8 %、10%、12% SDS-PAGE胶配制（2块胶)

1.4 主要仪器

2实验方法