PEP-1-MIT-hSOD2 K29R突变体的筛选、表达、纯化和体外抗帕金森病作用初步研究

摘要

目的： 将蛋白转导域(PTD)PEP-1和线粒体定位的人锰超氧化物歧化酶突变体(hSOD2K29R)进行融合表达，并研究线粒体靶向抗氧化蛋白PEP-1-MIT-hSOD2K29R突变体对MPP+损伤SH-SY5Y细胞的帕金森病(PD)细胞模型的保护作用。 方法： 利用生物软件SYBYL，ClustalX或者在线预测平台Swiss-model，HOT-MUSIC等分析预测出18个活力或者稳定性增大的hSOD2突变体，利用野生型pET-15b-hSOD2质粒为模板，通过PCR构建18个含定点突变的融合表达载体，并分别转入表达宿主，进行百草枯(PQ)抗性筛选，筛选出活力增大的突变体，电感耦合等离子体质谱法(ICPMS)检测Mn2+结合能力，SOD活力试剂盒检测在不同浓度变性剂SDS以及不同温度，不同pH条件下处理1h后的活力变化。并构建pET-15b-PEP-1-MIT-hSOD2突变体融合表达载体。使用E.coliBL21作为宿主进行蛋白表达，使用Ni-NTA纯化蛋白。MTT【3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐】法检测融合蛋白对1000μM MPP+诱导的SH-SY5Y细胞PD模型的保护作用和融合蛋白对SH-SY5Y细胞的毒性作用。免疫荧光法验证融合蛋白PEP-1-MIT-hSOD2突变体在SH-SY5Y细胞中线粒体定位作用。2'7'二氯荧光素二醋酸盐(DCF-DA)探针检测融合蛋白对PD细胞模型ROS的影响。Real-time PCR检测融合蛋白PEP-1-MIT-hSOD2突变体对PD细胞模型的炎症因子和凋亡因子影响。 结果： ①成功构建了18个pET-15b-hSOD2的突变体表达载体，并利用比较表达不同hSOD2突变体的E.coli的百草枯抗性筛选出活力最可能增强的hSOD2突变体K29R。 ②三维建模发现，hSOD2K29R活性中心Mn2+到与其结合氨基酸H74的N1原子键长变短，由2.05?变到2.01?。ICPMS检测出Mn2+结合量为0.966±0.025mol/mol protein，与野生型相比增加1.05倍。hSOD2K29R在高温、不同pH或不同浓度SDS处理1h后，活力比野生型蛋白大。 ③构建了pET-15b-PEP-1-MIT-hSOD2K29R融合表达载体，获得分子量大小为29.8kDa的蛋白，产量为每升LB培养基可表达59mg蛋白，纯度在90%以上。 ④MTT检测发现PEP-1-MIT-hSOD2K29R融合蛋白可以使MPP+诱导的SH-SY5Y细胞的存活率由53.4%增加到81.6%，且无明显的细胞毒性。 ⑤PEP-1-MIT-hSOD2K29R融合蛋白可以穿过SH-SY5Y细胞的细胞膜并进入线粒体，并降低MPP+诱导产生的ROS。1μMPEP-1-MIT-hSOD2K29R蛋白可以使MPP+引起的SH-SY5Y细胞的炎症因子TNF-α，IL-6和凋亡因子Bax的表达下调，使抑制凋亡因子Bcl-2的表达上调，调高Bcl-2和Bax的比例。 结论： 成功筛选出活力增大的hSOD2突变体hSOD2K29R。设计并表达出PEP-1-MIT-hSOD2K29R融合蛋白，它可以较好的清除MPP+诱导产生的ROS，并且可以穿过细胞膜并定位线粒体定位功能，可以下调PD细胞模型炎症因子TNF-α和IL-6的表达，调高PD细胞模型Bcl-2和Bax的比例，PEP-1-MIT-hSOD2K29R融合蛋白有望开发成为抗PD的新药。

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