埃博拉病毒核蛋白的表达及抗埃博拉病毒扎伊尔型核蛋白抗体的制备

摘要

埃博拉出血热（Ebola hemorrhagic fever）是一种由埃博拉病毒(Ebola virus)引起的急性病毒性传染病，是一种致死率很高的人兽共患病。最早于1976年在刚果(金)埃博拉河流域的苏丹南部和扎伊尔地区首次爆发，导致多人死亡。由于到目前为止，此种出血热并没有十分有效的治疗药物及疫苗，且在我国境内尚无此病症出现，因此，建立有良好特异性的检测方法显得尤为重要。本实验利用原核表达系统成功表达出埃博拉病毒五种亚型的核蛋白，并利用埃博拉病毒扎伊尔型核蛋白制备单克隆及多克隆抗体，为今后建立检测方法奠定基础。
　　 1.埃博拉病毒核蛋白的原核表达
　　 目的：通过原核表达系统获得埃博拉病毒重组核蛋白。方法：将埃博拉病毒核蛋白基因亚克隆入原核表达质粒pET-28-(a)中，构建重组表达载体pET-28-(a)-EBOV-NP。重组质粒鉴定正确后，转化BL21（DE3）感受态细菌，并利用终浓度为1mM/L的IPTG 诱导蛋白表达。蛋白成功表达后，将蛋白利用His-Band Ni+柱进行亲和层析纯化，然后通过Western blot 鉴定表达蛋白。结果：所构建的重组质粒双酶切产物在经过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定之后，得到与目的片段长度相同的特异性条带，可初步确定重组质粒构建正确。将重组质粒送样测序后， 测序结果显示与参考序列完全匹配没有突变。纯化后的蛋白经10％SDS-PAGE 鉴定，出现与国外文献报道大小相一致的特异性条带。经Westernblot 检测，所表达的蛋白可以与抗埃博拉病毒核蛋白多克隆抗体发生特异性反应。结论：所获得的重组融合蛋白有很好的反应原性。
　　 2.抗扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白多克隆抗体及单克隆抗体的制备将纯化后的扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白免疫日本大耳白兔及大鼠，5次免疫后采用心脏采血法，获得了抗埃博拉病毒扎伊尔型核蛋白的多克隆抗体。用间接ELISA 法检测所得多克隆抗体的效价为：兔血清效价1：512000；大鼠血清效价1：128000。经Western blot 检测，所制多抗与埃博拉病毒核蛋白有特异性反应。将纯化后的扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白免疫BALB/c小鼠，首次免疫时采用每只小鼠50ug蛋白加同等体积福氏完全佐剂，皮下多点注射。此后3次免疫采用每只小鼠50ug蛋白加同等体积福氏不完全佐剂，皮下多点注射。共4次免疫后，于细胞融合前三天，采用每只小鼠50ug蛋白不加佐剂加强免疫。3天后细胞融合。然后采用间接ELISA 法筛选出阳性细胞株后，再用有限稀释法对阳性细胞株进行3次连续克隆后，最终获得一株抗扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白的特异性杂交瘤细胞。其细胞培养上清的ELISA 效价为1：1.28×104，所制备得到的小鼠腹水的效价为1：3.2×106。这一株特异性单克隆抗体的成功制备为今后检测方法的建立打下了良好的基础。

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文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词表

声明

第1章绪论

第2章埃博拉病毒核蛋白的原核表达及纯化

第3章抗埃博拉病毒扎伊尔型核蛋白多克隆抗体的制备

第4章抗扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白单克隆抗体的制备

结论

参考文献：

致谢

作者简介

攻读学位期间发表的论文：