猪源与人源MRSA流行病学调查及对氟喹诺酮类药物耐药机制研究

摘要

金黄色葡萄球菌是人类重要的病原菌之一，其造成的感染能导致多种疾病，可以引起人的局部化脓性感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，也可以导致败血症、菌血症、脓毒症等全身性感染，严重时甚至威胁人类生命。甲氧西林应用于医学临床治疗金黄色葡萄球菌感染不久后，便出现了耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)。随着近些年来抗菌药物在临床的大量使用，MRSA耐药性日益严重，治疗难度不断加大，病死率也愈来愈高，如今已经成为全球性公共卫生问题。
　　 近年来，我国畜牧业集约化和规模化养殖程度逐渐提高，随着养殖场抗菌药物的大量使用，除了医院相关性(hospital-associated，HA-MRSA)和社区相关性感染（community-associated，CA-MRSA）之外，MRSA的流行病学也发生很大的变化，出现了另一类导致人类严重感染的牲畜相关性MRSA(Livestock-associated MRSA,LA-MRSA)，并已有多篇文献报道LA-MRSA能够在猪和人之间传播，给人类健康和MRSA疾病的治疗带来更不利影响。
　　 本研究于2011年8月-2012年6月分别从浙江省，江苏省，上海市中6个地区8个规模化猪场及1个屠宰场采集猪鼻腔拭子样品共计348份，在上海市某医院收集不同住院病人的痰和咽拭子等样品120份，所有样品分别通过75 g/L氯化钠肉汤预增菌、显色培养基显色培养、双重PCR（nuc和mecA基因）方法和耐药表型分离鉴定金黄色葡萄球菌及MRSA。共计分离到174株猪源金黄色葡萄球菌，其中89株为猪源MRSA，检出率为25.6％(89/348);医院分离到52株人源金黄色葡萄球菌，其中15株为人源MRSA，检出率为12.5％(15/120)。以微量肉汤稀释法进行药物敏感性试验。检测了89株猪源MRSA菌株对9类13种常用抗菌药物的敏感性，15株人源MRSA对8类10种常用抗菌药物的敏感性。猪源与人源MRSA除对利奈唑胺，万古霉素全部敏感外，对其他抗菌药物都表现出不同程度的耐药。值得注意的，本研究中分离的全部猪源MRSA都对截短侧耳类药物泰妙菌素、沃尼妙林以及人医新药瑞他帕林表现高水平耐药。这也提示我们要防控动物源耐药菌或耐药基因通过食物链或者环境向人类传播的潜在风险。
　　 采用金黄色葡萄球菌盒式染色体(SCC) mec、多位点序列(MSLT)和葡萄球菌蛋白A(spa)方法对猪源和人源MRSA进行分型。分型结果显示猪源MRSA全部为ST9-SCCmecⅣb型，其中80株为spa t899型，9株为spa t2922型。人源MRSA中14株为ST5-SCCmecⅡ-t002型，1株为ST88型，并且其spa分型为新型，已被命名为t10775型，这株SCCmec未能分型。综上结果本研究发现上海及周边地区猪源MRSA主要流行ST9-t899-SCCmecⅣb型，而人源MRSA主要流行ST5-t002-SCCmecⅡ型，猪源和人源MRSA之间暂未发现有相互传播的迹象。
　　 此外，本研究还从分离的菌株中选择部分猪源和人源MRSA，调查其靶基因突变对氟喹诺酮类药物耐药性的影响。调查结果显示在grlA，gyrA两个靶基因中，人源MRSA大部分为双点位突变，表现为MRSA对5种氟喹诺酮类药物的耐药值很高;猪源MRSA基本都为一个点突变，表现为MRSA对5种喹诺酮类药物的耐药值都很低。而grlB和gyrB两个靶基因突变较低，在grlB中只有一株菌突变，且为双点位突变（Glu561His，Gly571Val），在gyrB中也只有一株菌突变，为单突变(Ala496THr)。

目录

声明

摘要

插图清单

附表清单

缩略词表

第一章 绪论

1．1 研究的目的和意义

1．2 国内外研究现状

1．2．1 MRSA的全球流行病学调查

1．2．2 MRSA的分子分型

1．2．3 金黄色葡萄球菌对喹诺酮类药物的耐药机制研究进展

1．3 研究内容和研究方法

1．3．1 研究内容

1．3．2 研究方法

第二章 猪源与人源MRSA的分离、鉴定及耐药性调查

2．1 前言

2．2 材料

2．2．1 菌株

2．2．2 细菌培养基及其配制

2．2．3 抗菌药物标准品及其工作母液配制

2．2．4 缓冲液及其他试剂配制

2．2．5 其它试剂及试剂盒

2．2．6 主要仪器设备

2．3 方法

2．3．1 样本的采集

2．3．2 MRSA的分离和鉴定

2．3．3 抗菌药物敏感性试验

2．4 结果

2．4．1 金黄色葡萄球菌的初步筛选

2．4．2 金黄色葡萄球菌(SA)和MRSA的PCR分离鉴定

2．4．3 猪源MRSA对13种常用抗菌药物的敏感性试验结果

2．4．4 人源MRSA对10种常用抗菌药物的敏感性试验结果

2．5 讨论

2．5．1 MRSA的分离鉴定及流行情况分析

2．5．2 猪源MRSA的耐药情况分析

2．5．3 人源MRSA的耐药情况分析

2．6 小结

第三章 猪源与人源MRSA的分子分型比较研究

3．1 前言

3．2 材料

3．2．1 菌株

3．2．2 细菌培养基及其配制

3．2．3 PCR及克隆测序相关试剂

3．2．4 主要仪器设备

3．3 方法

3．3．1 MRSA染色体基因组的提取

3．3．2 多位点序列分型(Multilocus Sequencing Typing，MLST)

3．3．3 葡萄球菌蛋白A(spa)分型

3．3．4 SCCmec分型

3．4 结果

3．4．1 MLST分型结果

3．4．2 spa分型结果

3．4．3 SCCmec分型结果

3．5 讨论

3．5．1 猪源与人源MRSA spa及MLST分型比较

3．5．2 猪源与人源MRSA SCCmec分型比较

3．6 小结

第四章 猪源与人源MRSA靶基因突变与喹诺酮类药物耐药性关系研究

4．1 前言

4．2 材料

4．2．1 菌株

4．2．2 细菌培养基及其配制

4．2．3 抗菌药物标准品及其工作母液配制

4．2．4 缓冲液及其他分子生物学试剂配制

4．2．5 PCR及克隆测序相关试剂

4．2．6 主要仪器设备

4．3 方法

4．3．1 MRSA染色体基因组的提取

4．3．2 抗菌药物敏感性试验

4．3．3 喹诺酮类耐药决定区基因的扩增及测序

4．4 结果

4．4．1 MRSA对5种喹诺酮类药物的敏感性试验结果

4．4．2 grlA，grlB，gyrA，gyrB基因测序结果比对

4．5 讨论

4．6 小结

结论

致谢

个人简介

参考文献