马Ⅰ型RNA聚合酶启动子在流感研究中的应用及马IFITM蛋白抗流感病毒的研究

摘要

流感病毒反向遗传系统能够在体外对流感病毒的基因组进行操作，可以极大的方便对流感病毒的研究。流感病毒最小的复制单位由核糖核蛋白复合物（ribonucleoprotein complex，RNP）组成。在流感病毒反向系统中，PB1、PB2、PA、NP蛋白可以识别由I型RNA聚合酶启动子驱动生成的负链病毒RNA，并以此为模板转录生成正链互补RNA及mRNA。真核生物Ⅰ型RNA聚合酶启动子具有种属特异性。一种生物的Ⅰ型RNA聚合酶不能识别另一种生物的Ⅰ型RNA聚合酶启动子。研究者已经克隆了人源、犬源、鸡源、鼠源Ⅰ型RNA聚合酶启动子，并将其用于流感病毒反向遗传系统的构建。但是，目前为止，还没有马源Ⅰ型RNA聚合酶启动子的研究报道。因此，对于流感病毒的很多研究不能在马源细胞上进行。基于此，在本研究中，利用真核生物Ⅰ型RNA聚合酶启动子的位置特点，在GenBank数据库和ensembl数据库中的马基因组中，检索并确定了马Ⅰ型RNA聚合酶启动子转录起始位点。以马肺细胞基因组DNA为模板，通过PCR，扩增得到了马Ⅰ型RNA聚合酶启动子，并构建了不同长度的马Ⅰ型RNA聚合酶启动子驱动的马流感病毒小基因组复制系统。结果表明马Ⅰ型RNA聚合酶启动子为500bp时，可以发挥最大转录活性。用建立的马流感病毒小基因组复制系统，对比了两株马流感病毒聚合酶活性的差异，发现PA蛋白可能是决定两者聚合酶活性差异的关键蛋白。在本研究中，还使用该系统证实了马MxA蛋白会影响流感病毒聚合酶活性。最后，利用马Ⅰ型RNA聚合酶启动子构建了马流感病毒反向遗传系统，成功拯救出一株野生型马流感病毒和一株重组型马流感病毒。马Ⅰ型RNA聚合酶启动子的成功克隆及应用，丰富了我们对真核生物Ⅰ型RNA聚合酶启动子的认识。利用马Ⅰ型RNA聚合酶启动子构建的流感病毒小基因组复制系统是在马源细胞上研究流感病毒聚合酶活性的有效工具，而在此基础上构建的马流感病毒反向系统将方便研究者在马源细胞上对流感病毒进行操作。
　　最近的研究表明，人源、猪源、鸡源、鸭源、鼠源IFITM蛋白都具有抗流感病毒活性。马属动物是流感病毒的重要宿主，但对于马源IFITM蛋白是否也具有抗流感病毒作用却未见报道。在本研究中，通过在GenBank数据库中检索马IFITM基因，设计了靶向马IFITM基因的特异性引物。通过RT-PCR，扩增得到了6个马IFITM基因。首先，我们描述了马IFITM mRNA的表达特性：通过荧光定量PCR，检测了马源细胞及组织中的IFITM mRNA表达水平，发现不同IFITM的mRNA表达水平有所差异；经干扰素处理和流感病毒感染后，马源细胞中IFITM mRNA表达水平会上调；但是感染马疱疹病毒后，马源细胞中IFITM mRNA表达水平未发生变化。然后，为了明确马IFITM蛋白的细胞定位，构建了表达马IFITM蛋白的真核表达载体，间接免疫荧光和Western blot实验都表明马IFITM蛋白成功表达；激光共聚焦实验的结果表明不同马IFITM蛋白的细胞定位并不相同；其中，马IFITM3蛋白与LAMP1蛋白呈现共定位现象，而其它马IFITM蛋白不与LAMP1蛋白共定位。最后，通过瞬时转染外源表达质粒和构建稳定表达IFITM蛋白细胞系这两种策略，利于基于I型RNA聚合酶启动子的双荧光素酶报告系统，检测了马IFITM蛋白的抗流感活性：通过慢病毒感染实验，建立了稳定表达马IFITM蛋白的MDCK细胞系；间接免疫荧光试验的结果表明，在MDCK细胞系中，马IFITM蛋白都成功表达；利用基于马或犬I型RNA聚合酶启动子的双荧光素酶报告系统，证实在细胞中过表达或者稳定表达马IFITM蛋白都会限制流感病毒复制。对马源 IFITM蛋白的抗流感病毒活性研究，将加深我们对IFITM蛋白抗流感病毒作用的理解，也为相应的抗流感药物的研发提供了理论基础。
　　2012年以来，在马群中发现了三种新的黄病毒科病毒：马丙型肝炎病毒（equine hepatitis C virus，EHCV）、EPgV（equine pegivirus）、泰勒病相关病毒（Theiler’s disease-associated virus，TDAV）。目前，在世界范围内，关于这三种新发马病病毒的报道较少。在国内的马群中，也没有这三种病毒的流行病学报道。在2014年和2015年，我们从国内的马群中采集了177份血清样品。通过PCR，在血清样品中，检测到了6份EHCV阳性样品和2份EPgV阳性样品。在检测过程中，没有发现这两种病毒共感染的证据。在所有样品中没有检测到TDAV核酸。对EHCV的NS5B基因、NS3基因、5’非转录区序列以及EPgV的NS3基因序列进行进化树分析。结果表明，EHCV和EPgV已经进化为两个分支，而且这两支病毒都在国内马群中流行。本研究丰富了我们对这三种新发黄病毒科马病病毒的流行地区以及基因进化的认识。

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第1章 前言

1.1 马流感病毒的概述

1.2 流感病毒反向遗传操作技术的概述

1.3 抗病毒蛋白IFITM的概述

1.4 马群中新发黄病毒科病毒的研究进展

1.5 研究的目的与意义

第2章 马I型RNA聚合酶启动子的克隆及应用

2.1 引言

2.2 材料

2.3 方法

2.4 结果

2.5 小结

第3章 马IFITM蛋白对流感病毒的限制作用

3.1 引言

3.2 材料

3.3 方法

3.4 结果

3.5 小结

第4章 国内马群中新发黄病毒的分子流行病学调查

4.1 引言

4.2 材料

4.3 方法

4.4 结果

4.5 小结

第5章 全文讨论与总结

5.1 关于马I型RNA聚合酶的研究

5.2 关于马IFITM蛋白抗流感的研究

5.3 关于马群中新发病毒的分子流行病学研究

5.4 全文总结

致谢

参考文献

附录A：质粒图谱

附录B：攻读博士期间发表文章