多重耐药IncHI2型质粒在大肠杆菌中的检测及其全序列测定

摘要

近年来，革兰氏阴性菌特别是肠杆菌耐药性的不断加剧已成为严重的世界公共卫生问题。耐药基因主要通过质粒在不同来源（如人类和动物）细菌间传播，给人类健康和公共卫生造成很大威胁。IncHI2质粒是肠杆菌中最为流行的质粒型之一，常携带多种耐药基因，其介导的耐药基因传播已成为全球耐药性研究的热点。本研究以广东省内不同来源（动物源、食品源和医院人源）大肠杆菌为研究对象，分析IncHI2质粒的流行分布及其携带的耐药基因，并通过质粒的全序列测定进一步分析 IncHI2多重耐药质粒的结构特征，为减缓耐药性传播提供一定的理论依据。
　　采用PCR方法对2011年～2014年分离自广东省内不同来源的1844株大肠杆菌进行HI2复制子检测，结果显示，IncHI2质粒的检出率为2.6%（n=48），其中，鸡源大肠杆菌的检出率（4.3%）为所有来源菌株中最高，其次是食品源（2.9%）和猪源（2.2%），检出率最低的为医院人源菌株，仅有1.6%。48株IncHI2复制子阳性大肠杆菌通过接合或转化实验，成功获得接合子和转化子共40株，其中食品源16株、医院人源8株、鸡源11株和猪源5株。S1-PFGE结果显示所有接合子/转化子均只含有单个质粒，大小在150 kb~400 kb之间。对所有IncHI2质粒进行pDLST分型，主要为IncHI2-ST3型（n=32），其次是IncHI2-ST1型（n=3），仅有一株ST4型，其余四株分型失败。对40株接合子/转化子进行其余复制子的检测，结果发现其中17个 IncHI2质粒属于多复制子融合型质粒，包括IncFII（n=9）、IncN（n=6）及IncFII-IncN（n=2）型复制子。随机抽取5株IncHI2阳性大肠杆菌进行接合频率实验，结果显示IncHI2质粒的接合频率在10-5~10-3之间。
　　琼脂稀释法检测40株接合子/转化子对19种抗菌药物的敏感性，结果显示，对氨苄西林（97.5%）、头孢噻呋（85%）、安普霉素（70%）、氯霉素（80%）、氟苯尼考（70%）和复方新诺明（72.5%）均高度耐药；对黏菌素、磷霉素的耐药率分别为25%和35%。40株IncHI2阳性接合子/转化子除一株只耐2种药物以外，其余菌株均对3种以上药物耐药，22株（55%）为8耐~11耐。对40株接合子/转化子进行常见耐药基因的PCR检测，分别有30、32、14和8株检测出blaCTX-M、floR、fosA3和mcr-1基因。携带的blaCTX-M基因主要为blaCTX-M-14（n=9）和blaCTX-M-65（n=11），动物性食品源（56.3%）与医院人源（62.5%）blaCTX-M的检出率明显低于鸡源和猪源（100%）。本研究中，blaCTX-M-floR协同传播最为普遍（n=24），blaCTX-M-fosA3（n=11）、blaCTX-M-oqxAB（n=9）、blaCTX-M-aac(6')-Ib-cr（n=6）和blaCTX-M-oqxAB-floR（n=6）次之，另外，8株携带mcr-1的菌株均携带有blaCTX-M和floR。
　　选取来自猪源（SHP45）、人源（LDHF400）和食品源（YJMC8）携带的IncHI2-ST3质粒通过PacBio进行全序列测定，发现pHNSHP45-2、pHNLDF400和pHNYJC8大小分别为251493 bp、249152 bp、249153 bp，GC含量分别为46.53%、46.51%、46.51%。这三个质粒均包含IncHI2质粒的典型结构（复制区、接合转移区、先导区和耐药区），其中pHNLDF400和pHNYJC8全序列仅有2 bp的碱基差异，pHNSHP45-2的质粒骨架与pHNLDF400和pHNYJC8高度相似，除了pHNSHP45-2骨架位置上插入了ISApl1-mcr-1外。三个质粒耐药区插入骨架的位置相同，且均含有耐药基因oqxAB、sul1、ΔaadA2、dfrA12、aphA1、sul3、aadA1a、cmlA1、aadA2、floR、sul2、aph(4)-Ia和aac(3)-IV，不同的是pHNLDF400和pHNYJC8还包含基因盒aac(6’)-Ib-cr|blaOXA-1|arr3|catB3|qacEΔ1|sul1|，而质粒pHNSHP45-2则携带耐药基因blaCTX-M-14和fosA3。推测这些质粒可能来源于同一 IncHI2质粒，通过整合子、插入序列 IS26、ISApl1等携带耐药基因经过多步插入、重组进化形成。
　　综上所述，相似的多重耐药IncHI2质粒在我国不同来源（食品动物、动物性食品和医院人源）大肠杆菌中均有分布，介导mcr-1、blaCTX-M、fosA3等多种耐药基因在人、动物和食品之间传播。通过丢失或获得可移动元件（整合子、插入序列等），IncHI2质粒在不同来源大肠杆菌中不断进化和传播。IncHI2多重耐药质粒作为多种耐药基因传播的载体，其在不同来源大肠杆菌中的扩散对畜牧业的可持续发展、人类的健康和公共卫生都构成极大的威胁。

目录

声明

缩 略 词

1 前言

2.1材料

2.1.1 样品来源

2.1.2 标准菌株及载体

2.1.3 抗菌药物

2.1.4 培养基及其配制

2.1.5 试剂

2.1.6 主要仪器设备

2.1.7 主要试剂的配制

2.2方法

2.2.2 IncHI2型质粒的检测

2.2.3 接合频率

2.2.4 接合转移/电转化试验

2.2.5 携带HI2型质粒的接合子和转化子S1-PFGE分析

2.2.6 琼脂稀释法敏感性试验

2.2.7 单质粒接合子、转化子的耐药基因检测

2.2.8 质粒双位点序列分型（pDLST）

2.2.9 质粒的全序列测定

3 结果与分析

3.1细菌的复苏结果

3.2 IncHI2质粒的检测结果

3.3 IncHI2阳性菌株的接合转移和电转化实验结果

3.4 40株IncHI2阳性单质粒接合子/转化子的质粒特征

3.4.1 接合子/转化子的MIC结果

3.4.2 接合频率结果

3.4.3 接合子/转化子的其他复制子检测结果

3.4.4 接合子/转化子中相关耐药基因的PCR检测结果

3.4.5 接合子/转化子的pDLST分型结果

3.5质粒测序结果与分析

3.5.1 质粒测序结果

3.5.2 骨架结构分析

3.5.3 耐药区分析

4 讨论

4.1流行性分析

4.2 IncHI2型质粒特征分析

5 全文结论

致谢

参考文献

附录