百合MYC2转录因子在花香形成中的作用研究

摘要

‘西伯利亚’百合（Lilium‘Siberia’），有着洁白的花瓣和浓郁迷人的芳香，其花型态优美且花色丰富，在国际切花市场很受欢迎。‘西伯利亚’百合作为本实验研究材料，通过RT-PCR、GFP亚细胞定位、瞬时过表达、BSMV病毒沉默、荧光定量PCR、酵母双杂交（Yeast-two hybrid）和GC-MS等方法，研究了百合LoMYC2转录因子在花香物质形成中的作用以及与LoMYBs的互作关系。主要研究结果如下：
　　1.采用RT-PCR技术，从百合花瓣中克隆了的LoMYC2基因，该基因cDNA长度为2115bp，编码704个氨基酸(aa)，LoMYC2是亲水蛋白，分子量为76.6kDa，等电点(pI)为5.29。LoMYC2在N端有一个bHLH结构域和在C端有三个HLH结构域，属于MYC转录因子家族。进化树和氨基酸比对结果显示，LoMYC2与单子叶植物菠萝（Ananascomosus）和铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）的MYC2同源性最高。
　　2.采用RT-qPCR分析了LoMYC2的时空表达规律。结果表明LoMYC2在萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊、叶片、地上茎、鳞茎和根中均有表达，但雌蕊中表达量最高，其次是花瓣和地上茎，而根中表达量最低。LoMYC2的表达与开花进程不完全一致，花蕾到初开期LoMYC2表达量增高，半开期降到最低值，在盛开期到衰败期时表达量再次升高到达最大值。
　　3.对LoMYC2的亚细胞定位进行预测，在501-511有核定位信号PRPRKRGRKP，推测其定位在细胞核。进一步构建了LoMYC2的GFP融合表达载体，通过根癌农杆菌介导瞬时转化洋葱表皮细胞，并用细胞核染料DAPI染色，以空载p35S-GFP为阴性对照，只有细胞核呈现绿色荧光信号，证明LoMYC2定位于细胞核。
　　4.构建LoMYC2的植物病毒沉默载体，通过携带LoMYC2重组载体的根癌农杆菌侵染‘西伯利亚’百合花瓣和萼片进行瞬时干涉。结果表明，LoMYC2表达量下降47.33%，LoMYB1下降46.04%，LoMYB2下降43.85%，LoMYB3下降71.08%，LoAAT下降35.15%，LoTPS下降19.38%；用GC-MS对花瓣进行测气分析，罗勒烯含量下降57%，沉香醇下降79.36%，苯甲酸甲酯下降73.15%。
　　5.构建LoMYC2的植物过表达载体，通过携带LoMYC2的过表达载体的根癌农杆菌侵染‘西伯利亚’百合进行瞬时表达。结果表明过表达LoMYC2后，与对照相比，LoMYC2表达量升高89.27%，LoMYB1升高119.76%，LoMYB2升高1.2%，LoMYB3降低37.16%，LoTPS升高62.82%，LoAAT升高4倍。罗勒烯含量增加1.8倍，沉香醇增加1.78倍，苯甲酸甲酯增加1.1倍，别罗勒烯增加3.09倍。
　　6.构建LoMYC2全长酵母双杂交诱饵载体和LoMYBs全长酵母双杂交捕获载体，酵母双杂交结果表明LoMYC2能够与LoMYB1、LoMYB3互作。

目录

声明

缩略词中英文对照表

1前言

2.1 植物材料

2.2 主要药品和试剂

2.3 仪器设备

2.4 ‘西伯利亚’百合主要花香物质的测定

2.5 LoMYC2核苷酸序列的克隆

2.5 基因的表达

2.6 LoMYC2的瞬时病毒沉默实验

2.7 LoMYC2瞬时过表达实验

3 结果与分析

3.1 百合MYC2转录因子的克隆及生物信息学分析

3.2 LoMYC2的时空表达特性

3.3 瞬时病毒沉默MYC2转录因子对百合花香及相关基因表达的影响

3.4 瞬时过表达LoMYC2对百合花香及相关基因表达的影响

3.5 LoMYC2与LoMYBs的蛋白互作

4 讨论和结论

4.1 讨论

4.2 结论

4.3 进一步的研究设想

致谢

参考文献

附 录：

攻读硕士学位期间的科研成果