猪EXOC4基因表达调控及其繁殖性状相关研究

摘要

EXOC4基因(Exocyst complex component4)基因属于Exocyst complex基因家族成员之一。Exocyst complex基因家族主要参与囊泡转运的生物学过程有关。前人研究发现，EXOC4基因中第二内含子中存在两个SNPs位点与母猪的乳头数之间存在显著相关关系，而母猪的乳头数与母猪繁殖性能存在显著的正相关，尤其影响出生窝重与断奶窝重。此外，本课题组前期对猪重要经济性状的全基因组关联分析结果显示，EXOC4基因的第七内含子中SNP rs81471943与杜洛克猪的繁殖性状显著相关。因此，本研究分析了EXOC4基因不同基因型对母猪繁殖性状的影响，并探索EXOC4基因的表达调控机理，为其在母猪繁殖性状的分子调控机制奠定基础。
　　本研究以杜洛克猪、大白猪和长白猪及长大二元杂母猪为研究对象，通过PCR-RFLP技术进行EXOC4的基因分型，结合生产数据，分析不同基因型对母猪繁殖性状的影响。qRT-PCR定量分析EXOC4不同基因型母猪不同组织中mRNA水平的表达量变化。运用在线网站预测猪EXOC4基因启动子区转录因子，构建其缺失片段重组体，以猪卵巢颗粒细胞为细胞模型，通过双荧光检测确定核心启动子区。具体研究结果如下：
　　（1）克隆EXOC4基因第七内含子中存在与外种猪繁殖性状相关的rs81471943位点（16079181-16079820），在+149706bp处存在T＞C突变；
　　（2）在检测387头外种猪群体中，C等位基因的频率0.864，远远高于T等位基因的频率（q（T）=0.136），且在抽检的整个外种猪群体中，EXOC4基因符合哈迪-温伯格平衡定律；
　　（3）在杜洛克猪和长白猪群体中，EXOC4基因呈现出三种不同的基因型（CC、TC、CC）。在杜洛克群体中，CC型断奶窝重和断奶仔猪数显著高于TC型（P<0.05），但两种基因型个体在产仔数和初生重均表现差异不显著（P＞0.05）。而在长白猪群体中，CC型初生重和断奶仔猪数显著低于TC型（P<0.05），但两种基因型个体在产仔数和断奶窝重均表现差异不显著（P＞0.05）。而TT型个体与CC型和TC型个体在产仔数、初生重、断奶窝重和断奶仔猪数均表现差异不显著（P＞0.05）。在大白猪群体中，只有两种基因型CC和TC，两种基因型个体在产仔数、初生重、断奶窝重和断奶仔猪数均表现不显著（P＞0.05）。
　　（4）EXOC4基因在不同基因型CC和TC的长大二元杂母猪的各个组织中均有表达。在基因型TC中，表达量较高为肝脏，其次是小脑、肾、大肠，而在基因型CC中，表达量较高的是大肠，其次是小脑、大脑、肺。其次，在肝脏、肾脏、小脑组织中，TC型表达量显著的高于CC型，而在肺和卵巢组织中，TC型表达量则显著的低于CC型。
　　（5）克隆EXOC4基因启动子片段全长2791bp，并对外种猪进行启动子区遗传变异分析，发现SNP rs81471943不同基因型在EXOC4基因启动子区存在7个SNP位点，分别为-544C>G、-832G>A、-904G>A、-934G>A、-1646C>T、-1665A>G和-1781G>A。
　　（6）根据SNP rs81471943与EXOC4基因启动子区SNP之间关联，发现总共有5中不同的单倍型，除了WZ-2（AGTGAAG-T）比较少见，其他的都比较常见。构建其他4种单倍型的报告基因重组载体，转染猪卵巢颗粒细胞，结果WZ-1（GACGGGC-C）的活性显著高于WZ-4（AACAGGC-T）（P<0.5），且其他单倍型间的活性两两间均差异不显著（P>0.05）。推测-1781G碱基和-934G碱基可能是WZ-1（GACGGGC-C）与其它单倍型造成转录活性差异的原因。
　　（7）以前期克隆EXOC4基因启动子片段全长为模板构建EXOC4基因启动子报告基因重组载体，转染卵巢颗粒细胞，结果EXOC4-P2的活性较高，EXOC4-P3、EXOC4-P4活性显著降低（P<0.05）；EXOC4-P2活性显著高于EXOC4-P1活性（P<0.05）。其中，-1781G>A刚好位于猪EXOC4基因正调控元件结合位点区域，故推测-1781G碱基突变可能是导致母猪泌乳力差异的主要原因。
　　结论：猪EXOC4基因的5’调控区上游-1781bp处的G碱基的突变可能会影响外种母猪的泌乳力。

目录

声明

英文缩写词

1 前言

1. 1 影响母猪繁殖性状的因素

1. 2基因定位方法

1. 3 EXOC4基因及其研究概述

1. 4 本研究的目的意义

1. 5 本研究的技术路线

2 材料与方法

2. 1 实验材料

2. 2 实验主要仪器设备

2. 3 实验主要试剂来源及配制

2. 4 主要分子生物学数据库及生物学软件

2. 5 实验方法

3 结果与分析

3. 1 DNA的提取效果

3.2 SNPrs81471943位点的PCR扩增产物

3.3 EXOC4基因rs81471943位点PCR产物测序结果

3.4 猪EXOC4 基因rs81471943位点扩增片段 PCR-RFLP 检测

3.5外种猪中EXOC4基因多态性及不同基因型与繁殖性状的关系

3.6组织总RNA的提取结果

3.7长大二元母猪CC和TT基因型个体EXOC4基因mRNA不同组织表达水平定量分析

3.8 EXOC4基因启动子区SNP筛查与转录因子预测

3.9 EXOC4基因启动子活性分析

4 讨论与结论

4. 1猪EXOC4基因多态性与繁殖性状的相关性分析

4.2 EXOC4基因的组织表达谱及与SNPrs81471943关系

4. 3 猪E XOC4基因5’调控区的获得

4. 4 猪EXOC4基因5’调控区的的SNP筛查与分析

4. 5 不同单倍型对猪EXOC4基因的调控

4. 6 猪EXOC4基因启动子活性分析

4. 7 结论

致谢

参考文献