1,25(OH)2D3通过调节miRNA表达抑制大鼠肝星状细胞活化机制的研究

摘要

目的:
　　肝纤维化是各种肝病发展至肝硬化甚至肝细胞癌的共同的病理过程。目前研究表明，肝纤维化是一个高度动态发展的过程，有效的干预措施可延缓甚至逆转肝纤维化的发生发展，因此寻找有效的药物或治疗靶点来逆转肝纤维化过程就显得尤为重要。1，25(OH)2D3是维生素D在体内的活性形式，团队在前期的实验发现其具有抑制大鼠肝星状细胞增殖、促进其凋亡的作用，具有抗肝纤维化作用，但具体的作用机制尚不明确。miRNA是一类长度大约为18-25nt的单链非编码RNA，参与调控其他蛋白质编码基因的表达，研究发现很多的miRNA参与HSC激活、增殖，从而促进或抑制肝纤维化的发生发展。本研究目的是探索1，25(OH)2D3是否通过调节miRNA表达抑制大鼠肝星状细胞活化或通过调节miRNA介导的信号通路，从而发挥抗肝纤维化作用。
　　方法:
　　通过皮下注射CCL4和10pmmol/L TGF-β1刺激肝星状细胞分别构建体内和体外肝纤维化模型。转染miRNA mimics/inhibit在肝星状细胞过表达/抑制miRNA。1，25(OH)2D3分别作用于肝星状细胞和SD大鼠。通过qPCR筛选出差异表达的miRNA、验证转染是否成功及各组肝星状细胞中差异表达的miRNA表达量;通过CCK8检测肝星状细胞的增殖;通过流式细胞术检测肝星状细胞的凋亡;通过检测SD大鼠血清ALT及AST含量、HE染色的方法检测大鼠组织肝纤维化程度;采用生物信息学技术分析miRNA靶基因;Western blot法进行靶基因的验证。
　　结果:
　　1.与原代肝星状细胞相比，活化后的肝星状细胞中miR-146a、miR-30c、miR-193、miR-101、miR-200a表达均有异常，但其中以miR-146a变化具有统计学意义;
　　2.miR-146a mimics转染组大鼠肝星状细胞增殖率较miR-146a mimics NC组明显减少，miR-146a inhibit组增殖率较miR-146a inhibit NC组明显增加，1，25(OH)2D3组肝星状细胞增殖率较DMSO对照组明显减少;miR-146a mimics转染组大鼠肝星状细胞凋亡率较miR-146a mimics NC组明显增加，miR-146ainhibit组凋亡率较miR-146a inhibit NC组明显减少，1，25(OH)2D3组肝星状细胞凋亡率较DMSO组明显增加，(P＜0.05)，差异均具有统计学意义;
　　3.模型组和药物对照组中大鼠血清中ALT、AST表达量较正常组明显增加，药物治疗组中ALT、AST表达较药物对照组中明显降低(P＜0.05)，差异具有统计学意义;
　　4.HE染色显示模型组和药物对照组中大鼠肝肝组织肝纤维化程度明显，而药物治疗组中大鼠肝纤维化程度较药物对照组明显减轻。
　　5.模型组和药物对照组大鼠肝组织中miR-146a表达量较正常组明显下调(P＜0.05)，而药物治疗组大鼠肝组织中miR-146a表达量较药物对照组明显上调(P＜0.05)，以上差异均具有统计学意义;
　　6.生物技术分析显示DLL1为miR-146a潜在的靶基因，DLL1在模型组及药物对照组表达量较正常组明显增加(P＜0.05)，而在药物治疗组中表达量较药物对照组明显减少(P＜0.05)，差异具有统计学意义;
　　结论:
　　1.miR-146a在TGF-β1刺激的肝星状细胞和SD大鼠肝纤维化模型中表达是下调的。
　　2.1，25(OH)2D3具有抑制大鼠肝纤维化形成和抑制大鼠HSC活化的作用。
　　3.1，25(OH)2D3抗肝纤维化机制可能与上调miR-146a表达有关。
　　4.DLL1可能是miR-146a在肝纤维化组织中的靶点之一。
　　5.1，25(OH)2D)3可能是通过上调miR-146a的表达从而抑制Notch信号通路发挥抗纤维化作用.

目录

声明

摘要

英文缩词

前言

材料和方法

1．实验细胞

2．实验动物

3．主要药品和试剂

4．主要仪器

5．实验方法

6．检测内容和方法

7．统计学方法

结果

1．筛选出具有明显表达差异的miRNAs

3．细胞增殖率的检测

4．细胞凋亡率检测

5．SD大鼠基本实验结果

6．大鼠血清中ALT、AST检测结果

8．各组大鼠肝组织中miR-146a表达量

10．肝组织中α-SMA、DLL1、β-action表达情况

讨论

结论

致谢

参考文献

miR-146a在肝脏疾病中的作用

作者简介