印度南瓜(Cucurbita maxima Duch.)强雌基因精细定位及候选基因克隆与育种应用

摘要

印度南瓜（Cucurbita maxima Duch.），为葫芦科南瓜属重要的蔬菜作物，世界范围内广泛栽植，我国的南瓜种植面积及产量均居世界前列。强雌性状的利用可以显著增加南瓜田间产量，有效提高制种效率和种子的纯度，降低生产成本，提高种植效益，是南瓜作物中重要的育种目标之一。而目前，由于印度南瓜强雌性状为隐形基因控制，利用较为困难，且其产生的分子机理也不清楚。而对印度南瓜强雌性状控制基因的精细定位，进而克隆目标基因，并通过分子标记辅助选择进行利用，是提高南瓜育种效率的有效手段，也是解析强雌性状分子机理的必要途径。目前，对印度南瓜强雌性状基因定位的报道仅有两篇，存在定位区间较大，分子标记与目标基因连锁不够紧密等问题，而且候选基因尚未被克隆分析。所以我们在已有研究基础上进一步利用重测序等技术手段对印度南瓜强雌基因进行精细定位，预测候选基因，并对候选基因进行表达分析，同时将基因定位结果应用于南瓜育种中的强雌单株筛查与优良自交系的创制。本论文取得的主要结果如下:
　　1、利用重测序技术分别获得强雌性状定位群体双亲各8G左右的序列数据
　　对印度南瓜强雌性状定位群体双亲“强雌无杈150”与“小粒日母162-2”进行高通量重测序，以印度南瓜基因组序列作为参考基因组，分别获得8.6G和8.4G的测序数据。在本实验室前期该性状初定位的基础上，对初定位附近3Mb区域内的序列进行了高质量拼接，并筛查获得了双亲间分布于该区域的1015个InDel标记位点和3258个SNP标记位点。
　　2、印度南瓜强雌基因精细定位在第二染色的48Kb区域内
　　利用获得的InDel分子标记，对包含177株F2群体及97株BC1群体的强雌性状分离群体进行分析，将强雌性状控制基因定位在印度南瓜第二染色体48Kb的区域内，两侧标记为Cma02_05和Cma02_09。
　　3、定位区域包内有29个编码基因，Cma3_0000021基因可能为控制印度南瓜强雌性状的候选基因
　　利用印度南瓜全基因组注释结果对定位区域内的基因进行分析，该区域包含29个编码基因，其中基因Cma3_0000021与赤霉素调控相关，可能为控制强雌性状的候选基因。该基因序列在强雌与正常植株中存在2个SNP位点，导致蛋白编码提前终止。
　　4、候选基因Cma3_0000021的表达谱分析
　　对候选基因Cma3_0000021进行了表达谱分析，结果表明，该基因在植株雌花中表达丰度最高。在茎叶中也有少量表达，在根中不表达。
　　5、利用与强雌性状共分离的分子标记Cma02-08进行标记辅助选择育种
　　利用与强雌性状共分离的分子标记Cma02-08进行印度南瓜强雌性状的苗期筛查，辅助选育强雌自交系。根据对近1500株材料的筛查种植结果分析，筛选植株田间强雌性状表型一致。这种鉴定方法快速、可靠，大大节约了育种工作量。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 引言

1．1 植物性别分化研究

1．1．1 被子植物性别分化研究

1．1．2 环境与植物性别的关系

1．1．3 植物激素与植物性别的关系

1．2 葫芦科作物性别分化研究

1．2．1 黄瓜性别分化研究

1．2．2 西瓜性别分化研究

1．2．3 南瓜性别分化研究

1．3．1 分子标记的类型

1．3．2 南瓜重要基因的定位研究

1．3．3 重测序技术在目标性状精细定位中的应用

1．4 分子标记辅助育种

1．4．1 分子标记辅助选择

1．4．2 分子标记辅助育种中的应用

1．5 本研究的目的和意义

第二章 利用重测序技术对印度南瓜强雌性状精细定位

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料与种植

2．1．2 核酸样本采集与检测方法

2．1．3 主要试剂配制方法

2．1．4 基因组DNA样品建库测序程序

2．1．5 PCR反应体系

2．1．6 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染法

2．2 结果与分析

2．2．1 重测序样品DNA提取质量检测

2．2．2 亲本间的差异分子标记分析

2．2．3 强雌性状控制基因的精细定位

2．3 结论与讨论

第三章 候选基因预测及表达分析

3．1．1 试验材料

3．1．2 RNA提取方法与cDNA反转录

3．1．3 荧光定量PCR

3．2．1 区域内候选基因分析

3．2．2 候选基因Cma3_0000021的表达分析

3．3 结论与讨论

第四章 分子标记辅助育种在印度南瓜中的应用

4．1 试验材料与方法

4．1．1 试验材料与种植

4．1．2 试验方法

4．4．2 分子标记鉴定结果与田间植株表型结果相符

4．3 讨论

第五章 结论与讨论

5．1 结论

5．2 讨论

5．2．1 强雌性状的精细定位

5．2．2 候选基因功能分析

5．2．3 分子标记辅助选择育种

附录

参考文献

致谢

作者简历