构建新型同源全基因组杂交育种模型及酱油曲霉的分子育种

摘要

工业生物技术作为生物学、化学和过程工程学的交叉技术,被称为继80、90年代中兴起的医药生物技术和农业生物技术后的第三次生物技术革命浪潮,其核心目标是大规模采用微生物菌种和酶作为催化剂实现物质转化。故现代工业微生物育种技术是工业生物技术中的核心技术。而随着分子生物学和基因工程技术的飞速发展,给传统工业微生物育种技术注入了新的活力,其代表性的技术为基因组改组(Genome shuffling)。
　　 本研究在建立同源全基因组杂交育种模式的基础上,提出了一种新的杂交育种技术一片段化基因组改组(已申报专利),它是基于基因组改组(Genomeshuffling)原理,继承了基因组改组技术的多亲株、多轮改组的特点,将多亲株原生质体融合改进为多亲株(-母:受体菌,多父-基因组供体菌)的片段化基因组转化,并结合原生质体双灭活的筛选方法,逐步累积提高提高重组效率和重组随机性。
　　 本研究从各种商品曲精中分离纯化获得曲霉6株,鉴定为两个类型:酱油曲霉和米曲霉。选择中性蛋白酶活最高,生长旺盛、产孢能力强的酱油曲霉B I,作为菌种选育研究的出发株。
　　 1.紫外诱变构建候选株文库:对B I分生孢子的原生质体制备条件进行优化,并以B I孢子原生质体经紫外诱变处理,获得7株中性蛋白酶酶活得到提高的突变株,作为基因组改组的候选株文库。
　　 2.基因组改组:将诱变自BI的7株酱油曲霉菌株,通过多亲株孢子原生质体电融合,进行基因组改组育种,筛选得到9株高产中性蛋白酶的重组株,证明了基因组改组技术在酱油曲霉育种上的可行性。
　　 3.片段化基因组改组:以原始出发株酱油曲霉B I作为供体菌,诱变株UⅠ-2、UⅢ-21作为多供体菌提供基因组片段,经过一轮原生质体电转化,随初挑取56株进行检测,得到9株孢子及菌丝颜色由绿色改变为白色的菌株,5株中性蛋白酶活提高的菌株,从两方面证明了片段化基因组改组技术的可行性。当以颜色改变作为有效重组标准,本次实验间接有效重组频率达到16.07％。